Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами" -> 103

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами — М.: Наука, 1983. — 296 c.
Скачать (прямая ссылка): isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu
Предыдущая << 1 .. 97 98 99 100 101 102 < 103 > 104 105 106 107 108 109 .. 140 >> Следующая

При просчете радиоактивности таких фрагментов геля встают те же проблемы учета снижения выхода радиоактивности, что и для фильтров, но здесь они еще серьезнее как ввиду большей толщины срезов геля и расположения препаратов целиком внутри них, так и в связи с большей трудностью проникновения сцинтиллятора внутрь геля по сравнению с фильтром. Поэтому главные усилия были направлены на поиски наиболее радикального способа решения проблемы полного растворения геля. Ниже речь будет идти о полиакриламидном геле (ПААГ), поскольку растворение гелей агарозы осуществляется очень просто благодаря возможности их расплавления (см. ниже).
Чаще всего растворение ПААГ ведут путем окисления его перекисью водорода. Если радиоактивность содержится в углероде, то во избежание потерь ее с 14С02 его улавливают, добавляя до 1 % NH4OH. Простейшая методика такова: диск или срез пятна из ПААГ заливают 1 мл 30%-ного раствора Н202 с 1% NH4OH, выдерживают в закрытом флаконе при 65° в течение 4—6 ч до полного растворения, а затем заливают раствор в диоксановый сцинтиллятор. Для счета радиоактивности в толуольном сцинтилляторе сначала проводят неполное растворение ПААГ в уменьшенном объеме концентрированного раствора перекиси водорода, а для окончательного растворения и подготовки к внесению в толуол используют продажные солюбилизаторы. Например, диск ПААГ кладут в угол флакона и там подсушивают в течение ночи. Затем его заливают 0,25 мл 30%-ного раствора Н202 с 1 % NH4OH и держат в наклонном положении в течение 4—8 ч при 37°. Затем при комнатной температуре добавляют 1 мл солюбилизатора (NCS, Bio-Solv или Protosol) и после полного растворения — 5 мл толуольного сцинтиллятора.
Иногда вместо введения солюбилизатора при растворении ПААГ в 0,5 мл 30%-ной Н202 используют 5%*нук> концентрацию NH4OH. Для предупреждения потерь радиоактивности с летучими продуктами инкубацию в течение 6 ч при 37° ведут под тонким слоем парафинового масла. Затем добавляют 4 мл Aquasol и 50 мкл ледяной CHsCOOH [Lai et al., 1979].
В случае препаратов, меченных тритием, не приходится заботиться об улавливании С02. Растворение ПААГ в Н202 происходит лучше после предварительной краткой обработки геля хлорной кислотой. Диск ПААГ толщиной 1—2 мм заливают 0,2 мл 60%-ной НСЮ4, затем добавляют 0,4 мл 30%-ного раствора НД, туго завинчивают флакон и выдерживают его при 60° в течение 3—5 ч до полного растворения геля. После этого добавляют 10 мл Aquasol и через час считают. Использование концентрированной хлорной кислоты требует осторожности — она взрывоопасна.
Заметим в заключение, что небольшие потери “С02 или паров 3Н20 при растворении ПААГ неизбежны и могут быть неодинаковы от препарата к препарату, поэтому считать двойную метку “С и 3Н таким способом не рекомендуется.
Растворение ПААГ без Н202 с помощью солюбилизаторов
Soluene при 60—65° с энергичным встряхиванием за сутки растворяет ПААГ полностью. Счет можно вести в толуол-трито-новом сцинтилляторе. Однако поскольку солюбилизатор одновременно растворяет и выводит из геля радиоактивный препарат, нет необходимости добиваться полного растворения самого ге-
ля — достаточно обеспечить его сильное набухание. Это и имеет место при обработке ПААГ солюбилизаторами типа NCS и Protosol. Фирма «NEN» рекомендует для обработки препаратов в ПААГ использовать прямо 3%-ный раствор Protosol в Econofluor (10 мл), т. е. раствор солюбилизатора в сцинтилляторе. За ночь при 37° гель в таком растворе набухает, и около 80% радиоактивности белка выходит из него в сцинтиллятор.
Недавно предложена смесь, содержащая 6 г ППО, 10 мл NCS и 10 мл гиамингидроксида в 1 л толуола. По утверждению автора, за 24 ч при комнатной температуре до 95% радиоактивности белка выходит из ПААГ в эту смесь [Aloyo, 1979].
Во всех этих вариантах, вынув набухший диск геля, можно считать во флаконе двойную метку, в том числе с коррекцией тушения. Однако всегда остается опасение, что наиболее высокомолекулярные белки не полностью растворились и остались в геле, нарушив тем самым пропорции белкового состава препарата и распределение радиоактивностей в нем.
Растворимый ПААГ, например сшитый NN'-диаллилтартар-диамидом, легко растворить за 2 ч при комнатной температуре в 2—4 % -ном растворе ортоиодной кислоты. Раствор можно прямо вносить в толуол-тритоновый сцинтиллятор. Однако фирма «NEN» утверждает («LCS-Application Note» N28), что и в этом случае результат получается лучше, если вместо полного растворения геля элюировать из него белок в течение ночи при 37° обработкой 5%-ным раствором Protosol в Econofluor. Выход радиоактивности достигает 92%, а уровень эффективного сч:ета для JH поднимается до 44%.
Гели агарозы, как уже упоминалось, перед просчетом радиоактивности можно просто расплавить. К полоске агарозы, содержащей пятно или полосу нуклеиновой кислоты, добавляют 0,5 мл 1 н НС1 и нагревают до 90°. Агароза расплавляется; одновременно идет частичный кислотный гидролиз нуклеиновой кислоты, обеспечивающий ее растворимость в сцинтилляторе. Расплавленную агарозу охлаждают до 60°, добавляют 10 мл Biofluor или Aquasol-2 и хорошо перемешивают. Выход радиоактивности при этом достигает 99%, эффективность счета (для 3Н-белка) —34— 37%.
Предыдущая << 1 .. 97 98 99 100 101 102 < 103 > 104 105 106 107 108 109 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed