Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами" -> 104

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами — М.: Наука, 1983. — 296 c.
Скачать (прямая ссылка): isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu
Предыдущая << 1 .. 98 99 100 101 102 103 < 104 > 105 106 107 108 109 110 .. 140 >> Следующая

Элюция белков и нуклеиновых кислот из геля
Этот прием был подробно рассмотрен при описании методов электрофореза белков и нуклеиновых кислот [Остерман, 1981]. Здесь в качестве примеров приведем возможность элюции белков из ПААГ в 1%-ный раствор ДДС-Na с 6 М мочевиной при 37е за 40 ч [Buisson et al., 1976] и элюции ДНК в 0,5 М раствор CH3COONH4, содержащий 10 мМ (CH3COO)2Mg, 0,1% ДДС-Na и 0,1 мМ ЭДТА, при 37° за 10 ч [Maxam, Gilbert, 1977].
Что касается количественных оценок, то недостатком метода является неуверенность в полноте и отсутствии избирательности
элюции. Кроме того, трудно избежать значительного разбавления радиоактивности.
Перенос белков и нуклеиновых кислот из геля на нитроцеллю-лозный фильтр или диазобумагу путем вымывания, диффузии или электрофореза был рассмотрен в части II данной книги и подробнее — при описании электрофореза. Перенесенную на такой фильтр радиоактивность можно тестировать авторадиографически и просчитать, как описано выше. Иногда перенос носит почти количественный характер. Однако, как правило, приемы такого переноса используют не для определения радиоактивности, а для выделения определенных фракций препарата в целях дальнейшей обработки их на фильтре (иммунотестирования, гибридизации и др.).
Для качественных, прикидочных определений 14С (но не 3Н!) можно просто высушивать тонкие диски или кусочки ПААГ на поверхности стекловолокнистого фильтра или тонкой фильтровальной бумаги (30 мин при 50° или 2 ч на воздухе) до состояния тонкой пленки и просчитывать ее, как считают осадки на фильтрах. Даже для 3Н можно таким образом получить выход радиоактивности около 10% {Leinen, Wittliff, 1978].
Для счета радиоактивности в ПААГ можно импрегнировать сцинтиллятор в гель. Как и при сушке фильтра, при этом нужно убрать воду из геля и на ее место ввести толуольный сцинтиллятор. Например, для просчета радиоактивности 9Н-РНК описана следующая последовательность операций. Трубочку геля вымачивают в течение ночи в пяти объемах 10%-ной СН3СООН — это фиксирует полосы РНК и предохраняет гель от сжатия при последующей потере воды. Гель сканируют по УФ-поглощению и в нужных местах вырезают диски толщиной 1,1 мм. Каждый диск помещают во флакон с 5 мл абсолютного этанола и ведут дегидрирование в течение 2 ч. Затем этанол последовательно заменяют толуолом (1 ч) и 5 мл толуольного сцинтиллятора, содержащего 0,8% butyl PBD. Автор утверждает, что для трития ему удавалось достигнуть эффективности счета в 58% [Gezelius, 1977].
Следует отметить, что погоня за высокими выходом и эффективностью счета радиоактивности далеко не всегда оправдана. Зачастую радиоактивности в препарате имеется с избытком. Куда более существенную опасность могут представить собой диспропорции счета из-за неодинаковости выхода радиоактивности для разных компонентов разделенной смеси белков или нуклеиновых кислот. Методы счета радиоактивности нередко следует оценивать и выбирать именно с этой точки зрения. Разумеется, в этом отношении безупречен метод полного растворения препарата в сцинтилляторе.
Авторадиография
Этим термином обозначают метод регистрации положения полос и пятен радиоактивно меченных белков, нуклеиновых кислот и их фрагментов на пластинах геля после электрофореза и
в других аналогичных случаях путем контактной «фотографии»— почернения рентгеновской пленки непосредственно под действием Jl-излучения. Почернение, как обычно, обнаруживается после проявления и фиксации пленки. Авторадиографию используют также для отбора клонов микроорганизмов, несущих вектор со встроенной радиоактивно меченной ДНК или выявляемых по способности их ДНК гибридизоваться с радиоактивной «пробой» (см. ниже).
Энергия fl-излучения “Р достаточно велика, чтобы его авторадиографию можно было вести прямо с влажной пластины геля. Оставив ПААГ для жесткости на одной из стеклянных пластин (или уложив гель агарозы на стеклянную или пластиковую подложку), его заворачивают в тонкую полиэтиленовую пленку и закладывают в кассету соответствующего размера. Затем в темноте накладывают на гель рентгеновскую пленку, мягкую прокладку и крышку кассеты с пружинящими зажимами. Кассету заворачивают в черную бумагу и в таком виде экспонируют при выбранной температуре. Для последующего совмещения пленки с гелем на нем по углам делают отметки радиоактивными чернилами. На геле эти отметки видны невооруженным глазом, а на пленке появляется их авторадиографическое изображение. В качестве радиоактивных чернил можно использовать и обычные чернила, добавив в них какое-либо высокоактивное, меченное |4С соединение.
При авторадиографии соединений, меченных *4С, для уменьшения поглощения (1-частиц в самом геле его высушивают. Эту операцию удобно вести, уложив гель на листок толстой фильтровальной бумаги «Whatman ЗММ». Гель прилипает к бумаге, не
съеживается и, высыхая, дает прозрачную, плоскую и прочную пленку на бумаге. Бумагу кладут на пористую подложку, а ее — на перфорированную алюминиевую пластину. Сверху гель прикрывают полиэтиленовой пленкой и двумя слоями фильтровальной бумаги, а затем весь «сэндвич» помеща-S ют в полиэтиленовый мешок, который присоединяют к вакуумному насосу. Мешок можно нагревать в горячей воде или под лампой. Гель полностью высыхает за 1—2 ч. Разнообразные фирменные конструкции устроены аналогично, но вместо полиэтиленового
Предыдущая << 1 .. 98 99 100 101 102 103 < 104 > 105 106 107 108 109 110 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed