Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами" -> 112

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами — М.: Наука, 1983. — 296 c.
Скачать (прямая ссылка): isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu
Предыдущая << 1 .. 106 107 108 109 110 111 < 112 > 113 114 115 116 117 118 .. 140 >> Следующая

введения l25I в белок эти гранулы перемешивают с остальными компонентами реакционной смеси. Прекращают реакцию декантацией раствора. Торговое название материала — «lodo-Beads».
Другой вариант аналогичного подхода, т. е. введение водонерастворимого окислителя взамен раствора Хлорамина Т, можж> осуществить с помощью реагента, поставляемого той же фирмой под названием «lodo-Gen». Он представляет собой предложенный еще в 1978 г. 1,3,4,6-тетрахлор-За,6а-дифенилгликоурил [Fraker, Speck, 1978]. Реактив растворим в хлороформе и хлористом метилене, откуда его можно в виде пленки нанести на стенки пробирки. В воде он не растворим и играет роль твердого окислителя, ведущего иодирование белка. Для прекращения реакции раствор просто выливают из пробирки. Эффективность иодирования намного выше, чем у Хлорамина Т. Еще более существенно явное преимущество этого реагента в отношении мягкости воздействия и сохранения активности ферментов. Так, ли-зоцим в присутствии Хлорамина Т или N-хлорсукцинимида полностью инактивируется и выпадает в осадок, а при иодировании с помощью Iodo-Gen его активность не снижается.
ИОДИРОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ Н202 И ЛАКТ0ПЕР0КСИДАЗЫ
В этом методе, как и в предыдущем, производится иодирование тирозинов белка за счет Na125I, но вместо сильного химического окислителя используется ферментная система. Преимущество такого подхода состоит в том, что белок не находится в контакте с сильным окислителем. Иногда в этом направлении идут еще дальше и, чтобы избежать контакта белка с перекисью во-дорода, вводят две сопряженные ферментные системы: глюкоза и глюкозооксидаза образуют Н202 за счет воды и окисления глюкозы, а затем уже лактопероксидаза использует образующуюся перекись водорода для окисления иода.
Ниже описан простейший вариант процедуры иодирования [Bolton, 1977].
Исходные растворы: Na185I — 100 мКи/мл; 0,4 М CH3COONar pH 5,6; лактопероксидаза — 2,5 мкг/мл в 0,1 М CH,COONa, pH 5,6 (готовят из замороженного для хранения препарата с концентрацией 10 мг/мл непосредственно перед использованием); свежеприготовленный раствор Н2Ог (20 мкг/мл) в деионизованной воде; тирозин — 2 мг/мл в 0,05 М Na-фосфэтном буфере, pH 7,5; Nal или KI —2 мг/мл в том же буфере с 0,2% желатина; иодируемый белок — 0,2—0,5 мг/мл в 0,05 М Na-фосфатном буфере, pH 7,5. При хранении белка азид использовать не следует— он ингибирует лактопероксидазу.
В полистирольную пробирку вносят 10 мкл исходного раствора Na1J5I (1 мКи) и 20 мкл 0,4 М CH*COONa, pH 5,6. Непрерывно перемешивая, добавляют последовательно 10 мкл раствора белка (2—5 мкг), 10 мкл раствора лактопероксидазы
(0,025 мкг) и 10 мкл раствора Н202 (0,2 мкг). Инкубируют 7 мин при комнатной температуре и добавляют еще 10 мкл раствора Н202. Спустя 7 мин вносят еще раз 10 мкл На02. Еще через 7 мин останавливают иодирование белка внесением 0,5 мл раствора тирозина (I мг). Через минуту для подавления неспецифической сорбции 1251 и радиоактивного иодтирозина на белке дополняют смесь до 1 мл раствором Nal или KL содержащим желатину.
После этого определяют исходную ^-радиоактивность (все по-следующие просчеты радиоактивности ведут в том же объеме и в таких же пробирках). Очистку иодированного белка от невклточенной радиоактивности проводят путем гель-фильтрации, как было описано для иодирования с Хлорамином Т. Подсчет радиоактивности, включенной в белок, проводят так же по разности исходной суммарной и низкомолекулярной (после сефадекса) радиоактивностей.
При работе с ферментной системой, а тем более с двумя ферментами, не следует забывать, что одновременно с исследуемым белком иодируются и сами ферменты. Нередко из этого вытекает необходимость их последующего хроматографического отделения от основного белка [La Porte, Storm, 1978].
Введение U5I с помощью Н2Ог и лактопероксидазы в суммарные клеточные белки можно осуществить непосредственно в культуре клеток, без их предварительного разрушения. Фермент и Н202 проходят через клеточную мембрану [Horst, Roberts, 1979].
Необходимость отделения ферментов от исследуемого белка после окончания иодирования, естественно, поставила вопрос о возможности использования иммобилизованных ферментов для этой цели. Лактопероксидаза легко присоединяется BrCN-акти-вированной сефарозой, сохраняя свою ферментативную активность. На 1 мл влажной сефарозы можно «посадить» до 2,3 мг фермента (David, Reisfeld, 1974]. Перед использованием иммобилизованную лактопероксидазу каждый раз промывают для удаления фермента, который мог сняться с обменника во время хранения. В реакционную смесь на 10 мкг белка достаточно внести 10 мкл влажной сефарозы с лактопероксидазой и Н2Ог в концентрации 0,1 мМ. В присутствии 107 имп./мин Na125I и 10 мкМ KI реакцию иодирований ДНК-связывающего белка сыворотки человека, например, вели в течение часа при комнатной температуре [Parsons, Kowal, 1979]. Останавливали ее добавлением азида натрия — до 0,04%. Затем сефарозу с лактопероксидазой осаждали центрифугированием (2000 g; 15 мин). Очистку от невключенного в белок 1г51 проводили путем гель-фильтрации.
Предыдущая << 1 .. 106 107 108 109 110 111 < 112 > 113 114 115 116 117 118 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed