Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами" -> 111

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами — М.: Наука, 1983. — 296 c.
Скачать (прямая ссылка): isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu
Предыдущая << 1 .. 105 106 107 108 109 110 < 111 > 112 113 114 115 116 117 .. 140 >> Следующая

Реакция иодирования идет практически мгновенно. Между тем, Na125I (из-за интенсивной радиации и возможных примесей) и Хлорамин Т (как сильный окислитель) представляют опасность для нативности белка, поэтому контакт белка с ними должен быть сведен к минимуму. Вслед за Хлорамином Т в пробирку добавляют 100 мкл раствора тиосульфата натрия. Этот сильный восстановитель нацело блокирует оставшуюся окислительную способность Хлорамина Т. Затем реакционную смесь дополняют до 1 мл раствором Nal или KI. Назначение этой операции — конкурентное вытеснение 1251 из мест его неспецифической сорбции.
Исходную радиоактивность смеси просчитывают в ^-счетчике. Затем проводят отделение меченого белка от радиоактивного иода гель-фильтрацией на колонке Сефадекса G-25 (0,9X12см). Для насыщения центров сорбции через колонку предварительно пропускают 0,5 мл раствора (100 мг/мл) бычьего сывороточного альбумина. Элюцию белка ведут тем же 0,05 М Na-фосфатным буфером. Включение в белок лучше рассчитывать по разности исходного счета и суммарного счета низкомолекулярной части элюата. Тем самым исключаются потери счета белка в результате его неспецифической сорбции на посуде и сефадексе. Для вычисления удельной активности белка по его исходному количеству это может быть существенным. Счет радиоактивности в f-счетчике ведут каждый раз в объеме 1 мл. Иногда для уменьшения сорбции белка реакцию иодирования проводят в присутствии 0,1% ДДС-Na {Bray, Brownlee, 1973].
Недавно был предложен быстрый способ очистки белка от ,г51 путем центрифугирования «мини-колонки» G-25, изготовленной из конической полипропиленовой пробирки емкостью 1,5 мл, проколотой на конце. При внесении в такую колонку 0,1 мл белкового раствора и центрифугировании внутри второй пластиковой пробирки (200 g; 1 мин) белок полностью выходит из колонки, а свободный 1251 в ней на 99% задерживается [Tuszynski et al., 1980].
Все работы по иодированию белка следует вести под тягой из-за выделения в воздух паров радиоактивного иода.
Имеет смысл использовать для реакции Na125I без носителя, для того чтобы максимально снизить молярное отношение иод/ /тирозин. Этим обеспечивается получение в качестве продукта реакции только моноиодтирозина, что позволяет с большей сте-
пенью определенности проводить дальнейший анализ белка, например хроматографическое разделение пептидов.
Как уже упоминалось, при иодировании с помощью Хлорамина Т есть опасность окисления белка. В частности, остатки метионина могут окисляться до его сульфоксидов, что будет мешать получению BrCN-пептидов, а остатки цистеина в результате окисления могут образовывать избыточные дисульфидные мостики,, так что белок может оказаться инактивированным. Ввиду этой} SH-группы белка перед иодированием иногда тем или иным способом химически блокируют. Например, к раствору, содержащему 4—10 мг/мл белка в 0,02 М боратном буфере (pH 8) с 1% ДДС-Na и 10 мМ ЭДТА, добавляют 0,01% (1-меркаптоэтанола и до 10 мМ 2-оксиэтилдисульфита. Смесь выдерживают 5 мин при 100°. Все свободные SH-группы при этом блокируются оксиэтил-дисульфитом. Непрореагировавший дисульфит и меркаптоэтанол улетают. Белок (с подогревом) растворяют в воде и проводят реакцию иодирования с Хлорамином Т [Davison, 1976].
Иодирование белков после их фракционирования электрофорезом можно производить прямо в геле путем вымачивания его в соответствующих растворах Na?2SI, Хлорамина Т и тиосульфата натрия и последующих отмывок невключившихся предшественников. Это позволяет детектировать методом непрямой авторадиографии не обнаруживаемые иными способами белковые полосы [Christopher et al., 1978]. Разумеется, расход изотопа и Хлорамина Т при этом очень велик.
Если же белковые полосы после электрофореза в геле можно обнаружить обычной окраской, а введение радиоактивного иода используется только для последующего пептидного анализа, то поступают более экономно. Белковые полосы из геля вырезают. Один такой диск вымачивают в 0,3 мл 0,5 М Na-фосфатного буфера, содержащего 0,5 мКи NaI25I, и добавляют туда 5 мкл раствора Хлорамина Т, чтобы получить его концентрацию 0,1 мг/мл. Через 2 мин при 25° добавляют еще одну такую же порцию Хлорамина Т, а через 1 мин — еще одну. Затем реакцию останавливают добавлением 0,1 мл насыщенного водного раствора тирозина. Остальной 1251 присоединяется к нему и может быть удален диализом. Меченный таким образом белок можно гидролизовать, например трипсином, прямо в геле, а затем элюировать из него радиоактивно меченные пептиды белка, содержащегося в выбранной полосе геля [Bryant et al., 1979].
Отметим, что с помощью Хлорамина Т можно иодировать Тритон Х-100. Его алкилфенол похож на тирозин. Меченый Тритон Х-100 может представить интерес для исследования связывания его с белком и других реакций с участием этого широко используемого детергента [Fischetti et al., 1976].
В конце 1981 г. фирма «Pierce» сообщила о выпуске в продажу Хлорамина Т, иммобилизованного на носителе. На поверхности гранул полистирола закреплено большое число молекул Хлорамина Т, сохраняющего свои окислительные свойства. Для
Предыдущая << 1 .. 105 106 107 108 109 110 < 111 > 112 113 114 115 116 117 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed