Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами" -> 114

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами — М.: Наука, 1983. — 296 c.
Скачать (прямая ссылка): isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu
Предыдущая << 1 .. 108 109 110 111 112 113 < 114 > 115 116 117 118 119 120 .. 140 >> Следующая

Планируя реакцию иодирования белка с помощью реактива Болтона — Хантера, надо иметь в виду, что в воде он легко разлагается, отщепляя N-оксисукцинимид. Время полураспада при pH 8,5 составляет всего 9 мин. В мягких условиях реактив присоединяет метку пептидной связью в основном по концевым аминогруппам белка. До сих пор для иодирования белка успешно используют первоначальную методику [Bolton, Hunter, 1973].
5 мкг белка в 10 мкл 0,1 М боратного буфера (pH 8,5) вносят в пробирку, где находится 0,2 мкг реактива Болтона—Хантера, высушенного из соответствующей аликвоты его раствора в бензоле, хорошо перемешивают и держат 15 мин при 0°. При этом белок иодируется на 100%, а из внесенной радиоактивности на это расходуется около одной трети метки. Для связывания непрореагировавшего реактива добавляют 0,5 мл 0,2 М раствора глицина и держат еще 5 мин при 0°. Для предотвращения сорбции белка на сефадексе смесь дополняют до 1 мл 0,25%-ным раствором желатины в 0,05 М Na-фосфатном буфере, pH 7,5. После счета исходной ^-радиоактивности следует описанная выше очистка белка на колонке сефадекса. После предварительного пропускания через колонку бычьего сывороточного альбумина следует тщательно отмыть от него сефадекс тем же раствором желатины (на альбумине легко сорбируется радиоактивный продукт распада реактива). Белковые фракции для стабилизации белка лучше собирать в пробирки с внесенной туда сывороткой. В итоге можно получить белок с УА= = 1010 имп./мин на 1 мг.
Отметим, что в результате присоединения реактива Болтона—Хантера заряд полипептида уменьшается по крайней мере на единицу (если не считать возможной диссоциации фениль-ной ОН-группы). В случае иодирования относительно коротких
пептидов это обстоятельство можно использовать для отделения меченых пептидов от немеченных и от радиоактивных предшественников с помощью высоковольтного электрофореза на бумаге [Coutts, Reid, 1978].
Важное, а иногда и решающее значение при выборе метода иодирования белка имеет вопрос о сохранении его биологической активности. Болтон и Хантер в упомянутой работе 1973 г. продемонстрировали сохранение иммунореактивности многих белков после обработки 'предложенным ими реактивом. Недавно было тщательно обследовано влияние метода иодирования на биологические свойства кальмодулина. Оказалось, что иодирование с Хлорамином Т приводит к его полной инактивации, лактопероксидазный метод угнетает активность белка весьма существенно, а иодирование с помощью реактива Болтона— Хантера полностью сохраняет его биологическую активность [Chafouleas et al.,1979].
Фирма «NEN» разработала и продает меченный по 1251 реактив, предназначенный для иодирования только поверхностных белков клеточной мембраны, поскольку он не проникает внутрь клетки. Это диазопроизводное иодсульфаниловой кислоты имеет фирменное название «Iodosulfanilic acid, [125l]-Labeling Kit»;
его формула изображена выше. Отметим также препарат, сочетающий радиоактивную метку ,251 с флюоресценцией,— [*“1]-дииодфлюоресцеинизотиоцианат. Он мягко взаимодействует с белками и поверхностями клеток, позволяя сочетать методы регистрации радиоактивности с флюоресцентным детектированием и микроскопией. Описаны его синтез, очистка и использование [Gabel, Shapiro, 1978].
Конечный результат этой реакции тот же — иодирование белка по остаткам тирозина. Радиоактивный иод также вводится в виде Na Ш1 (или Na13*I), но вместо принудительного окисления аниона иода до катиона последний вводят в инкубационную смесь одновременно с Na ,251 в виде нерадиоактивного хлористого иода (IC1). Радиоактивный и нерадиоактивный иод равноправны в этих двух соединениях, поэтому между ними мгновенно происходит обмен, в результате чего в растворе в равновесной концентрации появляется 1251С1, т. е. необходимый для иодирования тирозина катион радиоактивного иода (1251+).
Хлористый иод представляет собой стабильный продажный
СГ
ИОДИРОВАНИЕ ЗА СЧЕТ Na12SI В ПРИСУТСТВИИ IC1
реактив. Кроме того, его легко получить обработкой водного раствора KI в смеси с КЮ3 концентрированной соляной кислотой.
Na Ш1 и IC1 добавляют к раствору белка эквимолярно, в четырехкратном молярном избытке по отношению к белку. Белок растворяют в 0,2 М боратном буфере (pH 8), Na 1251 вносят в том же буфере, а затем при быстром перемешивании добавляют раствор IC1 в 0,1 М НС1 с 0,15 М NaCI в объеме, равном примерно 0,1 объема смеси. Иодирование белка заканчивается за 1 мин. Затем для восстановления свободного Na ,251 добавляют избыток тиосульфата натрия. Очевидно, что в этом случае нельзя избежать включения в белок 50% «холодных» атомов иода, однако с учетом высокой УА исходных препаратов Na1Z5I такое разбавление радиоактивности приемлемо и даже окупается простотой метода. Очистку белка от предшественников можно вести обычным способом.
Этим можно закончить обзор способов введения радиоактивного иода в белки in vitro. Напомним, что они позволяют получить высокорадиоактивные, но короткоживущие препараты меченого белка. Наиболее широко эти приемы применяются в ра-диоиммунохимических методах исследования (см. ниже).
Предыдущая << 1 .. 108 109 110 111 112 113 < 114 > 115 116 117 118 119 120 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed