Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Остерман Л.А. -> "Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами" -> 108

Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.

Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами — М.: Наука, 1983. — 296 c.
Скачать (прямая ссылка): isledovaniebiologicheskihmakromolekul1983.djvu
Предыдущая << 1 .. 102 103 104 105 106 107 < 108 > 109 110 111 112 113 114 .. 140 >> Следующая

Заметим, что во всех вариантах цитируемого метода после осаждения ППО нет необходимости тщательно отмывать уксусную кислоту водой, так как, в отличие от ДМСО, кислота хорошо улетает при сушке. Гели агарозы мало изменяют свои размеры в органических растворителях. ПААГ в уксусной кислоте несколько набухает (в ДМСО—сжимается), и это еще увеличивает возможность введения ППО. Удобство использования СНзСООН состоит еще и в том, что она не нарушает окраски
полос красителем типа СВВ. Перед флюорографией белковые полосы следует прокрасить. Чувствительность метода от этого не страдает, так как краситель поглощает свет в красной области и пропускает голубую сцинтилляцию ППО.
Далее было найдено, что в качестве твердого сцинтиллятора вместо ППО можно использовать салицилат натрия. Максимум флюоресценции этого ароматического соединения лежит при 409 нм, что вполне приемлемо для регистрации на пленку. Кроме дешевизны, важным преимуществом салицилата натрия является его растворимость в воде — отпадает необходимость в замене воды в геле на органический растворитель. Рекомендуемая методика подготовки геля к флюорографии крайне проста. Пластину ПААГ вымачивают в 10 объемах 1 М водного раствора салицилата натрия в течение 30 мин при комнатной температуре. После этого ее кладут на листок «Whatman ЗММ», сушат в вакууме, а затем ведут флюорографию по методу Боннера и Ласки. Чувствительность получается не хуже, а полосы немного более диффуз-ны, чем при использовании ППО. Белки в геле можно предварительно фиксировать и окрашивать.
Раствор салицилата натрия хранится 1—2 недели, а потом приобретает коричневатую окраску (по-видимому, окисляется). Для хранения можно осадить салициловую кислоту добавлением эквимолярного количества НС1, осадок промыть на фильтре и высушить в течение ночи с отсосом. Салицилат натрия умеренно токсичен, но также проникает через кожу, так что работу следует вести в перчатках [Chamberlain, 1979].
Повышение чувствительности рентгеновской пленки путем ее предварительного засвечивания. Это неожиданное явление находит себе объяснение в механизме релаксации фотопроцесса. Общеизвестно, что существо этого процесса состоит в восстановлении под действием света ионов бромистого серебра до атомов серебра, что и обнаруживается при проявлении в виде почернения. На первом этапе процесса образование атомов серебра вызывает деструкцию кристаллической решетки AgBr и соответствующие напряжения в ней. Эти напряжения стремятся вернуть атом серебра в решетку кристалла, разумеется, снова в виде иона. Такая «релаксация» кристаллической решетки ведет к потере скрытого изображения. Именно с целью замедления релаксации и следует вести флюорографическое экспонирование, особенно малой радиоактивности, при —70°. И все же, если каждый кристаллик AgBr получает в среднем менее одного фотона в секунду, «стирание» изображения за счет релаксации становится достаточно вероятным процессом. Такая частота попадания фотонов как раз отвечает случаю регистрации малой радиоактивности слабого р-излучателя.
Между тем, если до релаксации в кристаллике AgBr успеет образоваться второй атом серебра, то искажение решетки оказывается столь сильным, что релаксация вообще не происходит. Предварительное, дозированное и равномерное освещение плен-
ки как раз и «заряжает» все кристаллики AgBr первым атомом серебра. Разумеется, это приводит к появлению на пленке некоего фона («вуали»), но зато даже при слабом ^-облучении атомы серебра будут накапливаться — релаксация и потеря изображения будут более или менее блокированы [Laskey, Mills, 1975].
Подбор условий предварительного освещения пленки ведут эмпирически. Оптимум лежит обычно в области, которой отвечает образование вуали с плотностью Aiit,=0,2-s-0,3 (после проявления). Освещать пленку следует не ранее чем за час до использования, и с этого момента ее держат все время при —70°. Пленку кладут освещенной стороной к гелю. В качестве ориентиров можно указать следующие условия предварительного засвечивания пленки: освещение фотовспышкой «Kodak» через оранжевый фильтр «Wratten» № 22 или 21, прикрытый листом «Whatman № 1», с расстояния в 70 см или освещение фотовспышкой отечественного производства типа СЭФ-2 или СЭФ-3 с расстояния 1 м.
Количественное определение радиоактивности
После флюорографии, если необходимо произвести количественное определение, полосы из геля можно вырезать, дать им набухнуть в минимальном количестве воды и далее солюбилизировать и просчитывать находящийся в них биологический материал, как было описано выше. При оценке эффективности счета в жидком сцинтилляторе надо учесть увеличение содержания в нем ППО или салицилата натрия, выходящих из геля; иными словами, следует принять во внимание изменение состава сцинтиллятора. Это заставляет пользоваться только методом внутренней стандартизации (см. выше).
Регистрация двойной метки (3Н и |4С) в ПААГ
Высокая чувствительность метода флюорографии позволяет в сочетании с авторадиографией производить сортировку пятен или полос в ПААГ по содержанию в них двух долгоживущих изотопов— 3Н и 14С. Таким образом можно обнаружить различия в составе двух сложных белковых смесей, например генетических вариантов. Белки одной смеси метят 3Н, а второй — 14С. Обе смеси объединяют и подвергают двумерному фракционированию в ПААГ по методу О’Фаррелла (см. часть I). Пластинку можно высушить, импрегнировать сцинтиллятором и путем флюорографии зарегистрировать суммарную радиоактивность (3Н + 14С) на пленку «Kodak XR-5». С негатива удобно сделать контактный отпечаток — пятна радиоактивности будут белыми на темном поле. С того же высушенного геля путем авторадиографии на пленке «Kodak NS-5T» при комнатной температуре регистрируют практически только 14С. Накладывают вторую пленку на первую. Не закрытые черным белые пятна указывают белки, меченные
Предыдущая << 1 .. 102 103 104 105 106 107 < 108 > 109 110 111 112 113 114 .. 140 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed