Исследование биологических макромолекул электрофокусированием иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами - Остерман Л.А.
Скачать (прямая ссылка):
Недавно фирма «Bio-Rad» выпустила под названием «Епгу-mobeads» гранулы гидрофильного носителя, на которых вперемежку иммобилизованы два фермента: глюкозооксидаза и лактопероксидаза. К раствору белка в нейтральном буфере для его иодирования добавляют суспензию «Enzymobeads», Na125I и глюкозу (см. «Bio-Rad Technical Bulletin N 1071 Е, July 1979).
Все же и при ферментативном окислении иода не удается полностью избежать опасности окисления и денатурации белка, поэтому в последние годы все большую популярность приобретает радиоактивная метка белка путем присоединения к нему иодированных реагентов.
С помощью Хлорамина Т за счет Na12iI в 0,1 н. HCI при 0° можно иодировать анилин. Затем действием нитрита натрия аминогруппу анилина можно заменить на диазониевую группу, по которой иодированное производное анилина в щелочной среде присоединяется к белку. Меченный таким образом белок легко очистить гель-фильтрацией [Hayes, Goldstein, 1975].
Одновременно было описано использование метил-п-окси-бензимидата в качестве промежуточного реагента, который можно иодировать, а затем присоединить к белку. Иодирование осуществляется также с помощью Хлорамина Т, а присоединение к белку происходит по аминогруппам за счет отщепления метилового эфира реагента. Примечательно, что при этом сохраняется положительный заряд белка.
Однако следует отметить, что при нейтральных и щелочных значениях pH фенольная ОН-группа в соседстве с двумя иодами легко диссоциирует (рК„ снижается до 6,5), что приводит к появлению дополнительного отрицательного заряда. Впрочем, то же самое имеет место и в дииодтирозине. Если это существенно, условия иодирования надо подбирать таким образом, чтобы включать только один атом 1251 на молекулу. В качестве исходного материала в описываемой реакции можно взять продажный п-оксибензонитрил и обработать его безводным метанолом в присутствии НС1:
ПРИСОЕДИНЕНИЕ СПЕЦИАЛЬНЫХ ИОДИРОВАННЫХ РЕАГЕНТОВ
0СН3
Хлорамин Т
оснл
+ н гн-\Белок\ —»-
Its,
Меченный иодом реагент (III) хорошо хранится при —20°. Введение метки в белок не связано с наличием в нем тирозина,
что позволяет получить высокое значение УА. Вуд и соавторы [Wood et al., 1975] таким образом иодировали белок до уровня 107 имп./мин на 1 мг.
Предложенный этими авторами реагент в настоящее время выпускается фирмой «Amersham» в готовом виде с УА>4000Ки/ /ммоль под названием «метил-3,5-ди[т1]иодоксибензимидата» (МИОБИ). Процедура введения метки в иммуноглобулин с его помощью была недавно подробно описана—удалось получить УА до 10е имп./мин на 1 мг иммуноглобулина. Иодирование идет достаточно медленно — в течение 100 ч инкубации при комнатной температуре включение метки в белок все еще нарастает. При 37е продолжительность иодирования можно ограничить 33 ч [Der-Balian, 1980].
Впрочем, Толан и соавторы отмечают, что иодированный бен-зимидат труднее реагирует с белком, чем неиодированный ме-тил-«-оксибензимидат (MPHBI — препарат фирмы «Pierce»). По их данным, уровень включения ,251 оказывается существенно выше, если иодирование вести после присоединения MPHBI к белку (лишенному тирозина). Так метили по 1251 рибосомные белки после их фракционирования электрофорезом в ПААГ. Белки извлекали из геля с помощью 1%-ного раствора ДДС-Na. В комплексе с детергентом их обрабатывали MPHBI (при 65°, 15 мин), от избытка бензимидата освобождали переосаждением комплекса ацетатом калия, а затем иодировали. В качестве окислителя использовали упомянутый выше «Iodo-Gen». Его осаждали на стенку пробирки из раствора в хлороформе. Авторы отмечают, что выбор стекла влияет на успешность иодирования. С боросиликатным стеклом результаты получаются хуже, чем с натриевым [Tolan et al., 1980].
Реактив Болтона—Хантера («Bolton—Hunter Reagent»), разработанный для этой же цели еще в 1973 г. [Bolton, Hunter, 1973], получил в настоящее время очень широкое распространение. Это — эфир N-оксисукцинимида и иодированной (1251) п-оксифе-нилпропионовой кислоты. Фирма «NEN» поставляет его еженедельно с УА= 1500 Ки/ммоль (однозамещенный по 1241) и УА= =4000 Ки/ммоль (двузамещенный) в виде бензольных растворов. Его можно получить и в лабораторных условиях на основе продажного препарата Ы-сукцинимидил-3-(4-оксифенил)-пропионата («NSHPP», фирма «Calbiochem») по следующей прописи [Bolton, 1977].
Реактив Болтона-Хантера
Исходные реактивы: NSHPP — 40 мкг/мл в смеси толуол— чти.пятгртят П • n- Na,2ST— 100 мКи/мл: Хлопамин Т — 5 мг/мл
0
в 0,25 М Na-фосфатном буфере, pH 7,5; тиосульфат натрия — 12 мг/мл в 0,05 М. Na-фосфатном буфере {последние два реактива должны быть свежеприготовленными); Nal и KI — 200 мг/ /мл; диметилформамид (ДМФ) и бензол. Все органические растворители должны быть безводными, перед использованием их следует перегнать.
В коническую стеклянную пробирку на 10 мл с притертой пробкой вносят 10 мкл раствора NSHPP. Растворитель выпа* ривают в вакууме или струе сухого азота. В пробирку кладут магнитик и при перемешивании быстро добавляют друг за другом 20 мкл Na125I, 10 мкл Хлорамина Т, 10 мкл тиосульфата натрия, 10 мкл Nal или KI, затем 2 мкл ДМФ и 250 мкл бензола. Закрыв пробку, пробирку осторожно встряхивают («Vortex») для экстракции образующегося реактива Болтона—Хантера в бензол. Бензольную фазу переносят в коническую пробирку, а водную экстрагируют еще 2 раза по 250 мкл бензола. Экстракты объединяют и измеряют ^-радиоактивность. Все операции можно уложить в 20 с. Бензол упаривают в вакууме или сухом азоте, стенки пробирки промывают бензолом и снова упаривают.
