Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 93

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 87 88 89 90 91 92 < 93 > 94 95 96 97 98 99 .. 122 >> Следующая

Глава 6
значениями pi можно использовать буферы с меньшим pH (до 4), что не
влияет на стадию преципитации или целостность геля. Другие свойства
буфера подбирают эмпирически. Буферы с низкой молярностью могут вызвать
колебания pH, а в буфере слишком высокой молярности гель может пере-
греться. Обычно используют буферы 0,02-0,075 М. Неоднократно показано,
что для хорошего разделения сложных смесей антигенов гораздо более важен
выбор анионов буфера, чем его pH. Однако вместе с тем существуют данные о
том,, что для разделения белков, мигрирующих близко друг к другу при pH,
например, 8,6, гораздо полезнее изменить pH, так чтобы приблизить его к
значениям pi белков и тем самым усилить эффект небольшого различия их
зарядов [12]. Препараты, плохо растворимые в воде (например, экстракты
клеточных мембран), успешно разделяются, если добавить в электродный
буфер и буфер геля соответствующий детергент, например ДСН.
II. Свойства агара и агарозы и электроэндосмос. При щелочных pH буфера
агар несет незначительный отрицательный заряд, обусловленный ионизацией
неорганических кислых групп. В результате гель приобретает постоянный
заряд, сбалансированный ионами НзО" растворителя. Это приводит к
возникновению в жидкой фазе геля слабого катодного тока, называемого
электроосмосом [12] или электроэндосмосом. Коммерческие препараты агара в
отличие от агарозы обладают ярко выраженными электроэндосмотическими
свойствами, и в результате [$2- и ^-глобулины, которые имеют в сыворотке
при pH 8,6 сильный отрицательный заряд (это молекулы с самым низким
значением рI), мигрируют к катоду (рис. 6.11). В этом нет большой беды,
поскольку, правильно подобрав анионы буфера, можно разделить изучаемые
антигены как в направлении и катоду, так и к аноду. Таким образом,
работая с агаровыми гелями, лучше вырезать лунки в центре пластины, чтобы
обеспечить миграцию белков к катоду. Часто наилучшее разделение
иммуноглобулинов на классы достигается именно в агаровом геле.
В отличие от агара некоторые коммерческие препараты агарозы обеспечивают
гораздо меньший суммарный заряд геля и обладают низкими
электроэндосмотическими свойствами. Следовательно, в такой агарозе
миграция 'ущюбулинов ПрИ pH 8,6 минимальна, однако антигены, мигрирующие
к аноду, разделяются очень хорошо. Агароза с низким электроэндосмосом
идеально подходит для методов, в которых антигены электрофоретически
мигрируют при pH 8,6 в гель, содержащий антитела (ракетный или двумерный
ИЭФ, см. разд. 4.2 и 4.3), или когда антитела перемещаются по направлению
к
Иммунодиффузия, ИЭФ, иммунохимическое окрашивание 221
антигену, быстро мигрирующему к катоду (встречный ИЭФ, см. разд. 4.4).
III. Реагенты. В лунки вносят 2-5 мкл антигена. Сыворотку можно
использовать неразведенной (для определения небольших концентраций
антигенов) или к разведении от 1:2 до 1:5. При определении
индивидуального белка с концентрацией 1 мг/мл с помощью сильных
антисывороток для получения удовлетворительных результатов достаточно 5
мкл препарата.
Количество антисыворотки, '.вносимой в канавки, следует подбирать таким
образом, чтобы получались четкие дуги преципитации, не выходящие за
пределы геля. Рисунок дуг зависит от соотношения концентраций антигена и
антитела в геле. Если специфичность антисыворотки высока, для достижения
удовлетворительных результатов достаточно внести в каждую канавку по 150
мкл неразведенной антисыворотки. В некоторых случаях необходимо через
несколько часов после начала реакции вновь наполнить канавку
антисывороткой. Другой способ - уменьшить антигенную нагрузку, если
только это не отразится на образовании дуг преципитации. Использование
цельной сыворотки, особенно если она содержит гемоглобин или большое
количество липидов, может затруднить отмывание геля от фонового
окрашивания. Поэтому лучше использовать IgG-фракции сывороток.
IV. Распределение препаратов на пластине. Для количественного определения
антигенов и антител в лунки той же пластины необходимо внести контрольные
антитела известной специфичности и стандартные антигены. Таким образам,
при оценке чистоты фракции сывороточных белков методом ИЭФ реагирующие
друг с другом контрольные сыворотку и антисыворотку следует расположить в
верхней части пластины, а исследуемые антигены чередовать со
стандартными. Примесц легко определить по расположению дуг преципитации,
а для подтверждения инородности каких-либо молекул используют
соответствующие специфические сыворотки. Аналогично и при исследовании
антисывороток для контроля используют сыворотки с известной
специфичностью.
V. Буферы. Резервуары для электродного буфера следует регулярно' мыть, а
буфер заменять -свежим. В старом буфере появляются загрязняющие примеси,
которые могут попасть в гель. Фитили тоже могут служить источником
загрязнения, и следует регулярно использовать новые. При частом
использовании камеры для электрофореза лучше каждый раз менять полюса
Предыдущая << 1 .. 87 88 89 90 91 92 < 93 > 94 95 96 97 98 99 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed