Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 88

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 82 83 84 85 86 87 < 88 > 89 90 91 92 93 94 .. 122 >> Следующая

между лунками 2 и 3, а также 3 и 4, принадлежат двум независимым
системам. Даже без стандартных антигенов и контрольных антител можно
предположить, что эти антигены не обладают частичной идентичностью,
поскольку линии преципитации не образуют шпор.
3.1.6. Преимущества и недостатки метода
Двойная диффузия в геле - это единственный в своем роде, уникальный и
простой метод изучения антигенных взаимосвязей между молекулами и
специфичности антител. Он имеет два главных недостатка: а) относительно
низкую чувствительность по сравнению с непрямыми методами, например
реакциями агглютинации и иммуноферментными тестами, и б) при исследовании
смесей антигенов методом ДДГ часто наблюдаются перекрывающиеся и
накладывающиеся друг на друга линии преципитации. В этом отношении ДДГ
уступает ИЭФ (разд. 4.1), в котором антигены разделяются в геле на
начальной электрофоретической стадии.
208
Глава 6
3.2. Радиальная иммунодиффузия (РИД)
3.2.1. Принцип метода
Молекулы в растворе, помещенные в лунки агарового геля, радиально
диффундируют и образуют иммунные комплексы с комплементарными молекулами
антител или антигенов, содержащихся [в жидкой фазе агара. В стандартной
РИД агар содержит моноспецифичеокие антитела, а радиально диффундирующий
антиген, встречаясь с ними, образует кольцо преципитации. До тех пор пока
в лунке сохраняется избыток антигена, происходит постепенное увеличение
диаметра кольца преципитации. Реакция протекает в течение нескольких
дней, причем время проведения определяется молекулярными размерами
антигена. В случае IgM (мол. масса 900 000) времени требуется по крайней
мере вдвое больше, чем для IgG (мол. масса 150 000). На практике, если
молекулы имеют размер IgG или менее, для построения количественной кривой
с использованием стандартных разведений антигена достаточно 24-часовой
инкубации при 4°С или 16-часовой при комнатной температуре.
Количественная оценка основана на том, что размеры кольца преципитации
прямо пропорциональны количеству антигена в лунке (при равных объемах
препаратов в лунках). По квадрату диаметра колец преципитации (D2) можно
судить о соотношении концентраций антигена в лунках даже при сокращении
времени инкубации. Для построения калибровочной кривой используют
стандартные разведения антигена, концентрация которых отличается в 10-20
раз и может достигать 5 .мкг/мл. Образцы соотносят с калибровочной
кривой, измеряя размеры кольца преципитации на еще влажном геле.
Аналогичный подход можно использовать для сравнения титра исследуемой
антисыворотки с контрольной. Данный метод известен под названием обратной
реакции радиальной иммунодиффузии (ОРИД), когда антисыворотка из лунок
диффундирует в агар, содержащий антиген.
3.2.2. Применение
I. Определение индивидуальных антигенов в растворе (РИД). Данный метод
обычно используют для определения сывороточных белков, в частности
иммуноглобулинов при подозрении на множественную миелому или в случае
недостаточности иммуноглобулинов. Можно определять и компоненты
комплемента. В основном с помощью РИД определяют любые антигены (при
наличии специфических антител), концентрация которых составляет не менее
5 мкг/мл и мол. масса не превышает 106. Необходим и стандартный препарат
антигена. Стан-
Иммуиодиффузия, ИЭФ, иммуиохимическое окрашивание_____________209-
дартный антиген не обязательно должен-быть чистым (так же как и опытные
образцы), а концентрации могут быть выражены в относительных единицах по
отношению к стандарту.
II. Титрование антисывороток с использованием контрольных реагентов
(ОРИД). Данный метод наиболее удобен для количественного определения IgG,
полученного путем хронической иммунизации лабораторных животных. Такие
антитела должны образовывать с антигеном одно кольцо преципитации. Кроме
того, метод можно использовать и для повседневного тестирования сывороток
пациентов с целью выявления антител к инфекционным агентам. Правда, в
ряде случаев чувствительность метода недостаточна.
3.2.3. Постановка прямой (для антигенов) и непрямой (для антител)
реакций
1. Расплавляют агарозу (или агар), как для ДДГ, и затем помещают флакон с
агарозой в водяную баню на 56°С.
2. Подогревают в бане несколько стеклянных пробирок объемом 15 мл.
3. Помещают стеклянные пластины на подогревную плиту (56°С). Можно
использовать подложки Gelbond.
4. Вносят в пробирки по 9,6 мл агарозы (одна пробирка на одну пластину).
5. Добавляют .в пробирки необходимое количество антигена или антител,
закрывают парафильмом и несколько раз осторожно переворачивают, чтобы
тщательно перемешать агарозу с реагентом. Не допускают образования
пузырей,
6. Переносят теплую пластину на горизонтальную поверхность и быстро
выливают на нее смесь агарозы с реагентом. Если необходимо, используют
линейку из твердого материала, чтобы равномерно распределить жидкость по
всей поверхности пластины. Пузыри удаляют, прикасаясь к ним донышком
пробирки, или отгоняя к краям.
Предыдущая << 1 .. 82 83 84 85 86 87 < 88 > 89 90 91 92 93 94 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed