Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 94

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 88 89 90 91 92 93 < 94 > 95 96 97 98 99 100 .. 122 >> Следующая

электродов, чтобы буфер в обеих камерах "стощалсм равномерно. Не
забывайте при этом изменить и ориентацию
222
Глава 6
пластины. Пригодность буфера можно определить, измерив напряжение на
пластине геля с помощью электрода.
4.1.5. Преимущества и недостатки ИЭФ
Иммуноэлектрофорез считается незаменимым методом для качественного
анализа смесей антигенов, например, сывороток. С помощью данного метода
можно идентифицировать до 20 компонентов смеси. Удается исследовать и
аномалии индивидуальных белков, поскольку на стадии разделения
обнаруживаются нарушения электрофоретической подвижности (например,
гомогенность pi миеломных белков), существенные отклонения от нормальной
концентрации (определяемые по интенсивности дуг преципитации) и изменения
субъединично-го состава (например, искажение соотношения легких цепей и и
А, у миеломных белков). Такие тонкие изменения трудно обнаружить с
помощью простой диффузии в геле. Осторожно подбирая агарный/агарозный
носитель, состав буфера и его pH, можно исследовать молекулы с самыми
различными зарядами. Применимость данного метода, как и всех других,
основанных на реакции преципитации, ограничена определением только таких
молекул, концентрация которых в растворе не менее или равна 5 мкг/мл, а
размеры не препятствуют образованию преципитатов.
4.2. Ракетный иммуноэлектрофорез
Ракетный иммуноэлектрофорез был разработан в результате дальнейшего
развития принципа комбинации электрофореза и иммунопреципитации. Он
позволяет быстро оценить концентрацию индивидуального антигена в реакции
с моноспе-цифической антнсывороткой.
4.2.1. Принцип метода
Индивидуальные антигены электрофоретически мигрируют из лунок,
расположенных у основания геля, в агарозу, содержащую специфические
антитела. С помощью специальных условий обеспечивается миграция антигена
к аноду и неподвижность антител (IgG). По мере связывания антител
мигрирующим антигеном образуются заостренные дуги преципитации (ракеты).
Высота ракет пропорциональна концентрации антигена. Если на пластину
нанесено несколько разведений стандартного антигена, то концентрации
неизвестных (опытных) •образцов легко определить, сравнивая их со
стандартной кри-
Иммунодиффузия, ИЭФ, иммуиохимическое окрашивание
вой. Для определения индивидуальных антигенов в смесях, гель должен
содержать моноспецифические антитела. Проводя реакцию с полиспецифической
антисывороткой, можно оценить, чистоту мигрирующего антигена, а используя
смеси антигенов - подтвердить моноспецифичность антисыворотки. Применение
теста ограничено антигенами, мигрирующими при; pH 8,6 к аноду, но, с
другой стороны, это очень быстрый метод (1-2 ч) количественного
определения таких антигенов.
4.2.2. Воспроизведение метода
1. Подготавливают пластину агарозного геля, содержащего антитела, как для
осуществления РИД (разд. 3.2). Концентрация антител может быть иной - ее
определяют эмпирически. Антисыворотки обычно используют в
концентрации
1-2% (объем на объем). Для уменьшения фонового окрашивания лучше
использовать
IgG-фракции антисывороток.
2. Когда гель застынет (предпочтительнее оставить на ночь при 4°С, для
того чтобы антитела равномерно распределились в геле), помещают
пластину на трафарет
(рис. 6.13) и вырезают перфоратором ряд из 11 лунок объемом 5 мкл.
Удаляют вырезанные кусочки геля.
3. Готовят несколько разведений стандартного антигена - для большей
точности рекомендуется использовать серию из пяти разведений: от 1 мг/мл
до 10 мкг/мл. Подготавливают три опытных образца (на одну пластину), в
двух разведениях, отличающихся друг от друга в 8 раз. Выбирают случайным
образом лунки для стандартных и опытных образцов и вносят в них по 5 мкл
- каждого образца.
4. Немедленно начинают электрофорез. Верхний край пластины должен быть
присоединен к аиоду. Для быстрого электрофоретического разделения при
(высоком напряжении необходимо водяное охлаждение. При напряжении 80-100
В (10-¦-12 В/см) электрофорез должен закончиться через 1-2 ч. Время
окончания определяют по ракете наибольшей концентрации стандартного
антигена. Когда ее пик заострится (рис. 6.14), ток выключают.
Рис. 6.13. Трафарет для проведения-ракетного ИЭФ на пластине 8X8 см-
224
Глава 6
Рис. 6.14. Ракетный ИЭФ. Иммуноэлектрофореграмма, полученная при
использовании пяти разведений стандартного антигена и двух разведений
трех неизвестных сывороток. Цель эксперимента - определение сывороточного
альбумина человека. К агарозному гелю (9,8 мл) добавили 80 мкл IgG-
фракции антител овцы к альбумину. Использовали двукратные разведения
стандартного антигена от 500 мкг/мл до 31,25 мкг/мл. Исследуемые
сыворотки разведены в 250 и 500 раз
4.2.3. Интерпретация резупьтатов
Во избежание латеральной диффузии антигена электрофорез начинают
немедленно после нанесения образцов. При ¦большой скорости разделения
ширина ракет не превышает диаметра лунок, что увеличивает точность
определения. Концентрации стандартов выбирают таким образом, чтобы
Предыдущая << 1 .. 88 89 90 91 92 93 < 94 > 95 96 97 98 99 100 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed