Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 99

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 93 94 95 96 97 98 < 99 > 100 101 102 103 104 105 .. 122 >> Следующая

блокирующее вещество (обезжиренное молоко), а затем интенсивно промывают
нитроцеллюлозу, по-
234
Глава 6
Г"брвзцы "в полосках Б11Ж
?-77 • -66
Образцы на пояосквх: МВТ
: -4 ¦' "Г
i:Z<>} i:SOO i• ООО МММ *: <?00 1;800 1:1600 1:1000 МММ 1:200 1:800
1:1000 МММ 1 ¦' 200 1:600 1:1600 1-1000
У НМС (кДв)--------------------V----------НМС (к Да)->-----НМС
(кДэ)-------------,---------НМС
МКА-Е94И Б 5.6 III М ы.ъи ^ SS.eTlT
Обрмиы на полосках: БЦЖ
Образцы не полосках: МБТ
1 \ 1 1
mb ты ' Г
ш* ш * |
"V. - L
' •* $ к У ж
" % ?
I*1 ¦--- %
'V
т
is(r)' : & •
: 1 I'ti 'л Ф
л
-66
-45
-30
-17
-1?
I
1:200 1:400 \;Н>А) 1:200 1;400 1:800 1:800 "мм 1:200 1:400 1:800 1:200
1:400 1:800
----------^------------------ N--------------- ИКС-----------------------
--------------------------------------------------------------------- ,--
-------------------------------------------------------------------------
-------------- .
Крооихы* ,п.,л т- • ' '
"ити-ка: 1224 е 1224 1226
Кроли**# антиеыясрогки: 1224 (кролик иммунизирован обработзниь'ми
ультразвукам М, wbercufotlt)
1226 (кролик иммунизирован обработанными ультразвуком М, bovis (БЦЖ)
Рис. 6.17. Примеры иммунохимического окрашивания реплик, полученных
методом Вестерн-блоттинга после электрофореза в ПААГ. Экстракты
дезинтегрированных ультразвуком М. bovis БЦЖ (слева вверху и внизу, БЦЖ)
и М. tuberculosis (справа, МБТ) разделили в 14%-ном ПААГ в
восстанавливающих условиях, перенесли с помощью электроблоттинга иа
нитроцел-люлозиую мембрану [включая и треки маркеров мол. массы (МММ,
кДа)], разрезали на полосы, содержащие по одному треку, и инкубировали в
индивидуальном порядке с антителами (треки МММ окрасили белковым
красителем). Полосы, расположенные в верхней части рисунка, инкубировали
с различными разведениями двух препаратов моноклональных антител (МКА) и
нормальной мышиной сыворотки (НМС) в качестве контроля. Эти полосы
окрашены антителами к мышиным иммуноглобулинам, конъюгированными с
пероксидазой хрена. Субстрат - диаминобензидин. Полосы, расположенные в
нижией части рисунка, инкубировали с двумя указанными кроличьими
антисыворотками и нормальной кроличьей сывороткой (ИКС) в качестве
контроля. Эти полосы окрашены антителами к IgG кролика, конъюгированными
с пероксидазой хрена
Иммунодиффузия, ИЭФ, иммунохимическое окрашивание_____________235
скольку следы молока, оставшиеся на ней, препятствуют реакции с
субстратом. Следует также отметить, что при исследовании антигенов
микроорганизмов в антисыворотке к иммуноглобулинам могут содержаться
антитела, перекрестно реагирующие с разделенными антигенами. Возможно,
придется предотвратить это нежелательное специфическое связывание путем
абсорбции конъюгата. Концентрация конъюгата, которую используют для
иммунохимического окрашивания в Ве-стерн-блоттинге, обычно примерно вдвое
больше той, которую применяют в ELISA для получения оптической плотности
окраски 1,0 за 20-30 мин при концентрации иммуноглобулинов,
адсорбированных в лунках панели, 1 мкг/мл. Как правило, если для EL1SA
конъюгат разводят 1 :5000, для блоттинга более чем достаточно разведения
1:1000.
2. При демонстрации связывания МКА с репликой антигена необходимо быть
уверенным в специфичности конъюгата. Каждое моноклональное антитело имеет
определенный изотоп. Для окрашивания реплики можно применять антитела,
реагирующие со всеми изотипами мышиных иммуноглобулинов, од-иако такую
специфичность следует подтвердить с помощью ELISA, используя для
связывания с лунками паиели чистые препараты всех изотипов. Другой способ
- проверить набор МКА всех изотипов с помощью Вестери-блоттинга.
3. Критическим моментом может быть разведение первых антител,
связывающихся с антигенами на нитроцеллюлозе. Чрезмерная их концентрация
может привести к появлению большого числа неспецифических полос, что
затрудняет интерпретацию результатов. Можно разделить один и тот же
антиген в нескольких треках геля и затем инкубировать их с разными
разведениями антител. Поскольку положительное окрашивание очень
чувствительно, концентрация антител может быть снижена до 1 мкг/мл.
Антитела в виде асцититных жидкостей можно разводить более чем в 1000
раз. ;
4. Не следует ожидать, что все МКА, активность которых подтверждена
другими методами, дадут положительную реакцию иммунохимического
окрашивания в Вестерн-блоттииге. Изменение структуры молекул антигенов в
условиях электрофореза в ПААГ приводит к разрушению многих эпитопов. По
разным оценкам только 10-30% МКА к сложным белковым антигенам окрашивают
реплики в любых концентрациях. С другой стороны, известны антитела,
которые лучше окрашивают денатурированные антигены. На рис. 6.17 показаны
результаты окрашивания реплик антителами к антигенам клеточной стеики
микобактерий. В этом случае сохранилась аи-тигенность исследуемых белков
пр.и осуществлении в денатурирующих и восстанавливающих условиях ИЭФ в
Предыдущая << 1 .. 93 94 95 96 97 98 < 99 > 100 101 102 103 104 105 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed