Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 89

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 83 84 85 86 87 88 < 89 > 90 91 92 93 94 95 .. 122 >> Следующая

7. После затвердевания геля помещают пластину во влажную кювету,
закрывают крышкой и убирают в холодильник на 4°С. Если в агар добавлен
азид натрия, пластины можно хранить неоколько дней. Тем не менее для
хранения в кювете используют чистую фильтровальную бумагу, смоченную
дистиллированной водой.
8. Помещают пластину на трафарет (рис. 6.7) и вырезают в геле лунки
диаметром 1,5 мм (объем 2 мкл) с помощью перфоратора. Удаляют вырезанные
кусочки геля.
9. Приготовляют в маленьких пробирках несколько разведений стандартного
антигена (для РИД) или контрольной антисыворотки (для ОРИД), а также
разведения опытных образ-
-¦210
Глава 6
дов и помещают в лунки по 2 м,кл каждого препарата с помощью мнкропипеши.
Для каждого образца используют отдельный наконечник. Выбор пипетки очень
важен - ошибки в .нанесении в основном и обусловливают плохие результаты.
10. Помещают пластину в закрытую кювету н оставляют на 24 ч (или на
ночь).
3.2.4. Технические замечания
1. Количество вносимых в гель антител пли антигенов определяют
эмпирически, учитывая количество стандартного антигена (или контрольных
антител) в лунках. Следует иметь эв "иду, что хорошую антисыворотку можно
добавлять в агарозу в концентрации 0,5% (объем на объем), а количество
антигена (для ОРИД) примерно составляет 20 мкг на 1 мл агарозы (200 мкг
на пластину). Стандартный антиген (для РИД) берут в концентрации 1
мг/мл - 5 мкг/мл
(20 мкг-10 нм на лунку). Контрольную сыворотку (для ОРИД) разводят до
соотношения 1:10. Исследуемые сыворотки вносят в лунки неразве-денными и
в разведении 1 :3.
2. Количество антител или антигенов, смешиваемых с агаром подбирают
таким образом, чтобы образовались кольца преципитации, диаметр которых
можно измерить на еще влажной пластине, причем размер кольца вокруг лунки
с максимальной концентрацией стандартного антигена (или контрольных
антител) по завершении реакции должен быть порядка 1 см. Чувствительность
метода можно увеличить, снижая концентрацию реагента, вносимого в агар, и
пропорционально уменьшая количества образцов в лунках. При уменьшении
количеств взаимодействующих реагентов образуются более бледные кольца
преципитации во влажном агаре. Можно увеличить контрастность, если
окрасить отмытые и высушенные пластины. Таким способом можно повысить
чувствительность метода определения антигена до I мкг/мл.
Рис. 6.7. Трафарет для реакций
РИД и ОРИД. Размеры стекла 8Х Х8 см, лунки образуют квадрат со сторонами
5 см
Иммуиодиффузия, ИЭФ, иммунохимическое окрашивание____________21_Й
3. Очень важно вносить в лунки каждой пластины серию разведений
стандартного антигена или антител, чтобы сравнивать с ними опытные
образцы. Сравнение опытных образцов на одной пластине с контрольными на
другой может исказить результаты, поскольку пластины отличаются друг от
Друга.
4. Чтобы нивелировать эффект возможных ошибок в нанесении образцов и
увеличить таким образом точность метода, разведения стандартного антигена
(или контрольных антител) следует вносить по крайней мере в двух
параллелях. Опытные образцы тоже лучше дублировать, а кроме того, можно
вносить их в двух разведениях.
5. Толщина агара должна быть равномерной по всей поверхности пластины.
Чтобы избежать неоднозначности результатов, вызываемой различной толщиной
геля в разных местах пластины, лунки для внесения стандартов нужно
выбирать, случайным образом.
6. Пластины следует подготавливать по крайней мере за. 1 день до
эксперимента и хранить при 4°С, чтобы внесенный в гель реагент равномерно
распределился. Если эксперимент предполагается проводить при комнатной
температуре, то перед нанесением образцов пластины следует вынуть из
холодильника, чтобы они согрелись.
7. Следите за тем, чтобы реакция протекала при постоянной температуре.
Сильные изменения температуры (например, от 4°С до комнатной) могут
привести к появлению нескольких колец преципитации в системе с одним
антигеном, поскольку растворимость комплексов зависит от температуры.
8. Желательно, чтобы антитела, вносимые в агар, представляли собой
фракцию иммуноглобулинов класса G. Таким образом можно уменьшить
концентрацию добавляемого в агар белка и тем самым фоновое окрашивание.
По этой же причине лучше использовать антитела с высоким титром,
концентрация которых в агаре может быть менее 1% (объем на объем).
9. Если для РИД антигенов используют моноспецифиче-скую антисыворотку,
стандартные антигены и опытные образцы не обязательно должны быть
чистыми. При определении белков в сыворотках пациентов в качестве
антигенного стандарта можно использовать цельную сыворотку. Точно так же
для титрования антисывороток методом ОРИД можно вносить в гель
неочищенный антиген, если опытные сыворотки моно-специфичны.
10. Для РИД малого количества образцов можно использовать стандартные
стекла для микроскопии. Объемы агарозы и реагентов в этом случае втрое
меньше, чем для пластин размером 8x8 см.
14*
212
Глава 6
3.2.5. Количественная оценка результатов
Предыдущая << 1 .. 83 84 85 86 87 88 < 89 > 90 91 92 93 94 95 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed