Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 96

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 90 91 92 93 94 95 < 96 > 97 98 99 100 101 102 .. 122 >> Следующая

II. Второе направление.
1. После застывания пластину геля переносят на охлаждаемую поверхность
камеры для электрофореза, так чтобы пластина первого геля была соединена
с катодным фитилем (т.е. второй электрофорез проводят под углом 90° к
первому). Второй этап электрофореза рекомендуется проводить при
напряжении 20 В (2,5 В/см) в течение ночи (16 ч). Если разделяемые
антигены предполагается использовать для иммунизации, электрофорез должен
продолжаться 24-48 ч.
2. Тщательно промывают гели в 0,85%-ном растворе NaCl и дистиллированной
воде, высушивают под прессом и окрашивают (разд. 3.1.4). Для подготовки
антигенов к иммунизации отмытый гель помещают на подсветку, вырезают
нужный пик преципитации и вымачивают его в 0,85%-ном растворе NaCl - 1-2
нед.
Примеры перекрестного электрофореза приведены в гл. 2 (рис. 2.2 и 2.7).
4.3.3. Технические замечания
1. Реагенты. Для разделения в первом направлении обычно используют лунки
объемом 2 мкл. Сы,воротки (неразведенные) наносят, как правило, в объеме
1 мкл. На втором этапе в гель добавляют 200-500 мкл антител (2,5-6%),
однако это зависит от соотношения концентраций антигена и антител.
Фоновое окрашивание белков можно уменьшить, используя IgG-фракцию
антисыворотки.
2. Очень важно добиться, чтобы между двумя этапами прошло как можно
меньше времени. Существенно проведение первого этапа на охлаждаемой
поверхности, поскольку это позволяет ускорить процесс и полуцить
сконцентрированные антигенные зоны. Охлаждение полезно и при разделении
на втором этапе.
3. Второй этап заканчивают после того, как вытянутся наиболее выраженные
пики преципитации. На электрофореграм-мах сывороток наибольший и
ближайший к аноду пик дает альбумин (не считая пика преальбумина). По
положению пика альбумина судят о качестве разделения в первом
направлении. Если пик альбумина доходит до верхнего края пластины,
значит, концентрация антител к суммарному пулу сывороточных белков
подобрана правильно.
4. Для определения аномалий сывороточных белков очень важно
стандартизировать эксперимент и использовать высококачественную
сбалансированную полиспецифическую антисыворотку.
15*
228
Глава 6
5. Если метод применяют для выделения антигенов, чрезвычайно важно
соблюдать чистоту на всех стадиях работы. Буферные емкости не должны
содержать посторонних белков (которые могут попасть туда из 'Предыдущих
гелей), бактерий и т. д. Для каждой пластины следует готовить новые
фитили.
6. При определении чистоты антигенов или специфичности антител
соответствующие концентрации должны быть в десять раз больше нормальных.
4.3.4. Преимущества и недостатки метода
С помощью одних и тех же антисывороток перекрестный ИЭФ позволяет выявить
большее число антигенов, чем простой ИЭФ. Дополнительное преимущество -
это возможность очистки антигенов. Наибольшая ценность перекрестного ИЭФ
заключается в том, что он позволяет определять специфичность антител в
неденатурирующих антигены условиях. В то же время электрофорез в
полиакриламидном геле в присутствии ДСН' с последующим Вестерн-блоттингом
и иммунохимиче-ским окрашиванием хотя и обладает очень высокой
чувствительностью, однако позволяет обнаружить только те антигенные
эпитопы, которые не изменяются после денатурации.
4.4. Встречный иммуноэлектрофорез
4.4.1. Принцип метода и области применения
Антигены, значение pi которых при pH 8,6 больше, чем у антител, находясь
в геле, обладающем высокими электроэндосмотическими свойствами, способны
достаточно быстро мигрировать к аноду навстречу антителам, которые
перемещаются из противоположной лунки к катоду. Использование этого
явления позволяет быстро получить линии преципитации между лунками с
антигенами и антителами при условии, что они внесены в соответствующих
пропорциях. Встречный ИЭФ - очень чувствительный и быстрый метод
определения как антигенов, так и антител (16]. Он широко применяется для
выявления инфекционных антигенов в физиологических жидкостях (например,
антигенов вируса гепатита В), изменений концентрации сывороточных белков
(например, а-фетопро-теина), а также для тестирования антител к целому
ряду антигенов, мигрирующих к аноду. Чувствительность метода достигает
400 нг/мл.
Иммунодиффузия, ИЭФ, иммунохимическое окрашивание_____________229
Аг Ат Аг А'/ Ат Ат Аг
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 о
0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 о
0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 о
0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 о
0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
4.4.2. Воспроизведение метода
1. Готовят обычным способом пластины геля, выбрав соответствующую
марку агара. Мы рекомендуем использовать агар Нобль фирмы Difco (1,2%).
Этот агар обеспечивает миграцию антител в барби-таловом буфере, pH 8,6, к
катоду.
2. Вырезают в геле лунки, используя трафарет (рис. 6.16).
Обычно вырезают два ряда лунок диаметром 2 мм, находящихся на расстоянии
6 мм друг от друга. В ряд лунок, расположенных ближе к катодному краю
пластины, вносят антигены (контрольные или исследуемые). В другой ряд
Предыдущая << 1 .. 90 91 92 93 94 95 < 96 > 97 98 99 100 101 102 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed