Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка):
лунок вносят по 5 мкл антител (исследуемые сыворотки или контрольные
антитела).
Подключают ток, так чтобы антигены мигрировали к аноду. Чтобы создать
оптимальные условия для преципитации хотя бы в одной паре лунок, следует
использовать разные разведения антигенов и антител. В поисках оптимальных
соотношений можно вырезать антигенные лунки разного размера и объема.
3. Проводят электрофорез при стабилизированном токе, равном 1,5 мА/см.
Результаты должны быть видны через 30 мин.
4. Чтобы повысить чувствительность определения, можно отмыть, высушить и
окрасить (разд. 3.1.4).
О
О
О
О
Рис. 6.16. Трафарет пластины 8Х Х8 см для встречного иммуноэлектрофореза
в агаре с использованием буферной системы, в которой антитела мигрируют к
катоду, а антигены - к аиоду. Два вертикальных ряда луиок слева
предназначены для тестирования антигенов или антител в зависимости от
того, имеются ли в наличии стандартный антиген (тест на антитела) или
контрольные антитела (тест иа аитигеиы). Три вертикальных ряда в центре
используются для одновременного определения антигенов и антител в опытных
образцах сыворотки. В левый вертикальный ряд вносят стандартный антигеи,
в правый - контрольные антитела, а в центральный - исследуемую сыворотку.
Луики, расположенные справа, предиазиачеиы для определения антигенов,
которые могут содержаться в образцах ц различных концентрациях. Если в
маленькие лунки вносить небольшие объемы (1-2 мкл), то по соотношениям,
оптимальным для преципитации, можно определить очень высокие концентрации
антигенов
гели
230
Глава 6
5. Вестерн-блоттинг и иммунохимическое окрашивание антигенных полос
5.1. Принцип метода и области применения
Молекулы, разделенные с помощью электрофореза в полиакриламидном геле,
можно электрофоретически перенести на нитроцеллюлозную мембрану, с
которой они свяжутся, воспроизведя картину элекрофоретического
разделения. Этот процесс называют Вестерн-блоттингом или
электроблоттингом [10, 17]. После блоттинга треки стандартного антигена и
маркеров мол. массы окрашивают белковым или углеводным красителем, а
остальные инкубируют с образцами антител [9, 18]. С помощью меченых
антител выявляют отдельные антигенные полосы (после электрофореза в
.восстанавливающих условиях -¦ субъединицы сложных молекул антигенов).
Эту стадию называют иммунохимическим окрашиванием. В полном варианте
метода используют как исключительную способность электрофореза в ПААГ
разделять молекулы, концентрации которых очень малы, так и свойство
антител выявлять специфические антигенные компоненты. Таким образом,
метод чаще всего применяют для определения состава и молекулярных
размеров антигенов, но, кроме того, он очень эффективен для определения
специфичности антител (в частности, МКА) и поиска антигенно родственных
молекул в однотипных или различных антигенных препаратах (например,
различные виды бактерий, вирусные мутанты, клеточные экстракты и т. д.).
5.2. Оборудование и материалы (см. приложение)
Аппарат для электроблоттинга с системой охлаждения. Нитроцеллюлозная
мембрана.
Крупнопористая фильтровальная бумага.
Листы тонкого полиэтилена (например, "Clingfilm").
Кюветы для отмывания и окрашивания.
Бритва или скальпель для разрезания мембраны на полоски.
Встряхиватель с подогревом.
Резиновые перчатки.
Емкость для полиакриламидного геля.
Буфер для блоттинга Глицин 2,93 г (39 нМ)
Трис 5,81 г (48 мМ)
ДСН 0,375 г (0,0375%, вес на объем)
Метанол 200 мл (20%, объем на объем)
Дистиллированная вода - до 1 литра.
Буфер для отмывания
Иммунодиффузия, ИЭФ, иммунохимическое окрашивание_____________231
PBS-твин: PBS, pH 7,2 (разд. 2.3), содержащий 0,05% (объем на объем)
твина 20.
Блокирующий буфер
PBS-твин, содержащий 5% (вес нв объем) растворенного обезжиренного сухого
молока.
Первые антитела, например мышиные МКА в виде асцитной или культуральной
жидкости, поликлональные антисыворотки (например, кролика, барана и т.
д.).
Вторые антитела (антиглобулины), например конъюгированные с пероксидазой
хрена антитела барана к мышиным иммуноглобулинам, антитела барана к
кроличьим IgG, антитела кролика к IgG барана.
Субстраты ферментов
Широко используются следующие субстраты, дающие не растворимые окрашенные
продукты:
1. З-Амино/4-этилкарбазол (АЭК) - красновато-розовый. 4 мг субстрата
растворяют в 200 мкл диметилформамида (ВВН), вносят в 10 мл 0,05 М
ацетатного буфера, pH 4,5 " фильтруют.
2. Диаминобензидин (ДАВ) -красно-коричневый. Перед использованием
фильтруют. Буфер для ДАБ - 50 мМ трис-буфер, pH 7,4. В 10 мл буфера
растворяют 0,5 мг субстрата. В оба субстрата добавляют Н202 (5 мкл на 20
мл). Авторадиография
Меченный иодом аффинно очищенный антиглобулин (см. кн. 2).
Рентгеновская пленка и кассета.
Усиливающий экран (необязательно).
Проявитель (Kodak D19) и фиксаж.
5.3. Воспроизведение метода
5.3.1. Элехтробяоттииг
Чтобы не загрязнить нитроцеллюлозу, все процедуры выполняют в резиновых
перчатках.
1. Отделяют полиакриламидный гель от стекла в кювете с дистиллированной
