Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 92

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 86 87 88 89 90 91 < 92 > 93 94 95 96 97 98 .. 122 >> Следующая

(разд. 3.1.3).
2. Цомещают пластину на трафарет (рис. 6.10), с обеих сторон пластины
помещают две подставки для металлической линейки, по которой
остроконечным скальпелем прорезают границы канавок. С помощью
перфораторов диаметром 1,5 или 2,3 мм вырезают лунки, а затем последним
вырезают концы канавок. В продажу поступают разнообразные коммерческие
модели ножей для гелей (см. приложение). Удаляют вырезанные кусочки геля
из лунок. Переворачивают пластину и, держа ее на уровне глаз, подцепляют
конец каждой полоски геля в канавках, чтобы полоски выпали.
3. Наливают буфер в резервуары камеры для электрофореза и подают воду в
змеевик охлаждающей пластины.
4. Вносят антигены в лунки, а на поверхность геля перед одной из лунок
помещают кристаллик бромфенолового синего. Обрезают верхний правый угол
геля, чтобы пометить верхний (анодный) край [на стекле (или подложке
Gelbond) мож-
218
Глава 6
Рис. 6.12. Примеры иммуноэлектрофореграмм. А. Электрофореграмма некоторых
сывороточных белков человека, полученная с помощью набора мо-
иоспецифических антисывороток. Все лунки содержат нормальную сыворотку
человека. В канавках-специфические аитисыворотки к (а) суммарному пулу
сывороточных белков; (Ь) сывороточному альбумину; (с) а-1-аи-титрипсину;
(d) орозомукоиду; (е) СЗ-компоненту комплемента; (f) транс-феррину; (g)
IgA; (h) IgG. Б. Выявление миеломных белков IgG" и IgAj, в сыворотках
двух пациентов с помощью соответствующих антисывороток, Лунки: (1)
нормальная сыворотка человека, (2) сыворотка больного IgG*-миеломой; (3)
сыворотка больного IgAx-миеломой. Канавки: аитисыворотки к (а) цельной
человеческой сыворотке; (b) IgG (Fc-специфическая); (с) легким цепям к;
(d) IgA (Fc-специфическая); (е) легким цепям Миеломиые белки в сыворотке
можно обнаружить по характерному изгибу дуги преципитации в форме лука,
которую образует патологический иммуноглобулин благодаря высокой
концентрации гомогенного белка. Кроме того, в зоне преципитации
миеломного белка гомогенные легкие цепи концентрируются в области изгиба
и в результате линия преципитации легкой цепи
выглядит укороченной
¦но вытравить кодовый номер]. Помещают гель на охлаждаемую пластину
камеры для электрофореза, так чтобы канавки шли от буфера к буферу.
Подготавливают два марлевых фитиля размером 25x8 ем, омачивают их в
буфере, избыток буфера отжимают и прикладывают короткими сторонами к
противоположным краям геля, чтобы соединить резервуары для буфера через
гель друг с другом. Для обеспечения непрерывно-
Иммунодиффузия, ИЭФ, иммунохимическое окрашивание 219
го контакта, осторожно прижимают фитили к краям геля, предварительно
смочив пальцы в буфере.
5. Закрывают камеру крышкой (в современных камерах 'контактные разъемы
для безопасности находятся в крышке). Присоединяют к камере провода,
соблюдая полярность (анод-к правому краю пластины). Проверяют полярность
проводов на источнике питания и включают ток. Создают напряжение около 80
В на пластину (10 В/см), при этом сила тока составляет 12 мА на пластину
(1,5 мА/см). В большие камеры для электрофореза можно помещать до пяти
пластин одновременно при параметрах тока 150 В и 60 мА. Проведение
электрофореза при очень большом напряжении может привести к перегреву,
деформации и высыханию геля, и ток перестанет проходить.
6. Убеждаются, что бромфеноловый синий мигрирует к аиоду. При pH 8,6
скорость его миграции должна составлять около 4 см/ч. Прежде чем открыть
крышку и осмотреть пластину, обязательно выключают источник тока.
Электрофорез заканчивают, когда краситель переместится к краю канавки.
7. Немедленно переносят гель в неглубокую влажную камеру и помещают на
столик с уровнем. Вносят в каиавки около 150 мкл соответствующих
антисывороток и закрывают крышку камеры. Не двигайте камеру (например, не
помещайте ее в холодильник) до тех пор, пока сыворотка не войдет в гель.
8. Для прохождения реакции преципитации гели обычно оставляют на ночь при
4°С. Если реакцию проводят при комнатной температуре, проверяют гель
через несколько часов и, если необходимо, останавливают реакцию, промыв
гель водой до того момента, когда дуги преципитации еще сохраняют
четкость. Лучше фотографировать влажные пластины в рассеянном свете,
заполнив канавки водой. Нижнюю стеклянную поверхность пластины можно
обезжирить глицерином. Пластины отмывают, высушивают и окрашивают так же,
как и при осуществлении им,мунодиффузии в геле (разд. 3.1.4). Для
удаления из геля сывороточных белков его следует отмывать очень
тщательно. Фоновое окрашивание белков уменьшается, (c)ели в качестве
антител используют IgG-фракцию сыворотки.
4.1.4. Технические замечания
I. Электродный буфер и буферы для геля. При pH 8,6 большинство белков
мигрируют к аноду, поэтому для анализа сывороточных и других белков
обычно используют барбита-ловый буфер, pH 8,6, а лунки вырезают иа
катодной стороне пластины. Однако для лучшего разделения белков с
другим'и
220
Предыдущая << 1 .. 86 87 88 89 90 91 < 92 > 93 94 95 96 97 98 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed