Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 95

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 89 90 91 92 93 94 < 95 > 96 97 98 99 100 101 .. 122 >> Следующая

образовавшиеся ракеты не выходили за пределы пластины и ракета стандарта
наибольшей концентрации занимала всю длину геля. Двойные или
множественные ракеты указывают на то, что антисыворотка не моноспецифична
(см. гл. 2, рис. 2.3).
4.2.4. Количественная обработка результатов
1. Для быстрого получения результатов можно измерить высоту ракет,
положив гель на стекло с подсветкой. Ракеты измеряют от вершины до
верхнего края лунки. Если имеется достаточно времени, гель промывают 2-3
дня в 0,85%-ном растворе NaCl, затем в дистиллированной воде, высушивают
и окрашивают, а затем проводят измерение.
Иммунодиффузия, ИЭФ, иммунохимическое окрашивание 225
2. Для определения количества антигена в неизвестных образцах строят
калибровочную ,кривую, откладывая значения высоты пиков от концентраций
стандартного антигена. Неизвестные концентрации определяют с помощью
данной кривой. Чувствительность метода находится в пределах 5 мкг/мл. Ее
можно увеличить, уменьшив концентрацию антител и соответственно
стандартных антигенов. В этом случае, чтобы увидеть и измерить ракеты,
пластины, скорее ,всего, придется окрасить. Точность определения - 5-10%.
4.2.5. Преимущества и недостатки метода
Главное преимущество описанного метода количественного определения
антигенов по сравнению с РИД - это быстрое получение результатов. Однако
ракетный ИЭФ применим только к тем молекулам, которые обладают средним
или сильным отрицательным зарядом при pH 8,6, что исключает возможность
определения иммуноглобулинов, для которых нужно подбирать специальные
электролиты и агар. Отрицательный заряд исследуемых иммуноглобулинов
можно увеличить кар-бамилированием как опытных, так и стандартных
сывороток. Это достигается следующим образом [13]:
1. Добавляют к двум объемам 2М KCNO один объем сыворотки.
2. Инкубируют при комнатной температуре 6-18 ч. На практике удобнее
определять иммуноглобулины и комплемент с помощью РИД. Если же нужно
быстро .получить результаты или исследовать большую серию образцов, лучше
применить нефелометрический и сходный с ним турбодиметрический методы
[14, 15].
4.3. Перекрестный иммуноэлектрофорез
4.3.1. Принцип метода и области применения
Данный метод совмещает в себе электрофоретическое разделение антигенов в
одном направлении иа первой стадии и принцип ракетного ИЭФ в другом
направлении (под углом 90°) на второй стадии. Разделенные антигены
мигрируют в агарозу с полиспецифическими антителами и образуют узор из
ракет. Метод имеет большое аналитическое значение для исследования
состава антигенов и, кроме того, обладает некоторыми чертами
количественных подходов. Он очень полезен для тестирования чистоты
антигенов, мигрирующих к аноду, а также специфичности антисывороток.
Любые белки, которые входят в гель, содержащий антитела, но не образуют
пре-
15-997
226
Глава 6
ципитатов, можно удалить из геля, продолжая электрофорез до тех пор, пока
они не выйдут из него со стороны анода. Таким образом, данный метод можно
использовать для очистки комплексов антиген - антитело и пики
использовать для иммунизации. Это открывает доступ к большому количеству
антигенов, которые трудно очистить другими способами. Сравнивая
антигенные пики на пластинах с известными стандартами, можно производить
количественную оценку смесей антигенов. Это позволяет, в частности,
определить изменения состава сыворотки при заболевании. Можно наблюдать
за изменениями индивидуальных белков, например активацией (ферментативное
расщепление) третьего компонента комплемента (СЗ) и протеолизом других
белков. Метод можно использовать и для проверки специфичности
антисывороток, внесенных в гель для осуществления второго этапа.
4.3.2. Воспроизведение метода
I. Первое направление.
1. Приготовляют агарозный гель на барбиталовом буфере, как в случае ИЭФ и
ДДГ (разд. 3.1.3). Подложки Gelbond не используют.
2. С помощью трафарета (рис. 6.15) разрезают гель на полоски шириной 1
или 1,5 см и в указанных местах вырезают лунки.
3. Вносят в лунки антигены и проводят электрофорез (см. разд .4.1.3).
Когда бром-феноловый синий окажется на
расстоянии 1 см от анодного края пластины, выключают ток.
4. Немедленно переносят полоску с разделенными антигенами на другую,
стеклянную пластину. Пластина должна быть теплой. Полоску геля укладывают
на край пластины (можно использовать подложку Gelbond), а на остальную
поверхность наносят 8,5 мл заранее подготовленной смеси агарозы с
антителами при 56 °С. Новый гель должен плотно соединиться с пластиной
первого. Эту стадию следует выполнять как можно быстрее, чтобы свести к
минимуму диффузию зон разделенных антигенов в переносимой полоске геля.
Полоску удобнее всего переносить на лезвии секционного ножа.
Удаляют
Удаляют
Первое направление
Рис. 6.15. Перекрестный иммуноэлектрофорез. Трафарет пластины 8X8 см для
электрофоретического разделения антигенов в первом направлении.
Иммунодиффузия, ИЭФ, иммунохимическое окрашивание_____________227
Предыдущая << 1 .. 89 90 91 92 93 94 < 95 > 96 97 98 99 100 101 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed