Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 98

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 92 93 94 95 96 97 < 98 > 99 100 101 102 103 104 .. 122 >> Следующая

водой.
2. Переносят гель на толстую фильтровальную бумагу, пропитанную буфером
для блоттинга, и помещают все это на еще несколько слоев пропитанной тем
же буфером фильтровальной бумаги.
3. Отрезают квадратный листок нитроцеллюлозной мембраны подходящего
размера, смачивают буфером для блоттинга и помещают на гель. На
нитроцеллюлозу помещают несколько слоев увлажненной фильтровальной
бумаги. Можно восполь-
232
Глава 6
зоваться пробиркой в качестве валика, чтобы удалить пузыри воздуха и
обеспечить плотный контакт всех слоев друг с другом.
4. Плотно зажимают получившийся сандвич, согласно инструкции к вашему
аппарату, и вставляют в камеру для блот-тинга. С обеих сторон от сандвича
помещают электроды, так чтобы анод находился со стороны нитроцеллюлозной
мембраны. Проходящий через систему ток должен увлекать молекулы из геля
по направлению к нитроцеллюлозе. Включают охлаждение (или помещают
аппарат в холодную комнату).
5. Включают ток. Требуемая напряженность поля определяется исходя из
площади и толщины геля. Ориентировочное значение - 0,8 мА/ем2.
Рекомендуемое время переноса белков из геля толщиной 1 мм в современном
аппарате типа Multip-hor II фирмы LKB - 45-60 мин. При использовании
менее эффективных неохлаждаемых аппаратов процесс может потребовать более
длительного времени - до 16-25 ч. В системе Multiphor можно проводить
блоттинг с нескольких гелей одновременно. В этом случае каждая пара гель-
нитроцеллюлоза отделяется от другой листом полиэтиленовой пленки
(например, Clingfilm), смоченной буфером.
6. После блоттинга нитроцеллюлозную мембрану хранят в буфере для
отмывания (PBS-твин) между двумя листами фильтровальной бумаги до
окрашивания. Добавление твина существенно для блокирования участков
неспецифического связывания иммуноглобулинов "а стадии иммунохимического
окрашивания.
5.3.2. Иммунохимическое окрашивание
Существуют два метода иммунохимического окрашивания. В первом используют
антитела, меченные радиоактивным иодом, а затем проводят авторадиографию.
Второй метод основан на принципе ELISA и предусматривает использование
антител к иммуноглобулинам, конъюгированных с ферментом, и реакцию
локального окрашивания, когда субстрат превращается в нерастворимый
окрашенный продукт в участках расположения комплексов антиген - антитело
[10]. При использовании любого метода возникают проблемы неспецифического
связывания, которые в обоих случаях решаются одинаково. Благодаря
простоте и возможности длительного хранения реагентов иммуноферментный
метод применяют чаще, за исключением тех случаев, когда требуется высокая
чувствительность. Ниже приведено описание иммуноферментного метода, а в
технических замечаниях описана процедура авторадиографии. Методы
приготовления антител к иммуноглобулинам описаны
Иммунодиффузия. ИЭФ, иммунохимическое окрашивание_____________233
в гл. 2. Технология конъюгации антител с ферментами (например,
пероксидазой хрена, ПХ) описана в кн. 2. Существуют коммерческие
препараты конъюгированных с ПХ антител к иммуноглобулинам различных видов
животных (см. приложение). На рис. 6.17 приведены результаты Вестерн-
блоттинга, полученные при использовании иммуноферментного метода.
1. Промывают мембрану в буфере PBS-твин в течение по крайней мере 1 ч, а
затем разрезают ее на треки и нумеруют их, чтобы не перепутать.
Окрашивают полосы, содержащие стандартный антиген и маркеры мол. массы,
красителем для белков (или углеводов), как описано в гл. 2 (разд. 3.2.2,
п. 7). Таким образом, вы удостоверитесь, что блоттинг прошел успешно, а
потом сможете использовать эти полосы для сравнения.
2. Помещают остальные полосы в небольшую емкость и заливают раствором
первых антител в буфере PBS-твин. Инкубируют 30-60 мин при 37 °С,
желательно на встряхивателе. Для стандартизации результатов рекомендуется
процедуры инкубации и отмывания выполнять каждый >раз в течение одного и
того же времени, например 1 ч.
3. Тщательно отмывают полосы 30-60 мин в буфере PBS-твин и заливают
раствором антииммуноглобулинов, конъюгированных с ПХ, в блокирующем
буфере. Инкубируют 30- 60 мин при 37 °С и перемешивании.
4. Вновь отмывают полосы, помещают их в небольшие емкости, заливают
раствором субстрата в соответствующем буфере. Помещают на встряхиватель и
наблюдают за развитием окраски. На этой стадии не допускают попадания на
полосы яркого света.
5. Когда полосы станут хорошо видны, останавливают реакцию, отмыв полосы
буфером PBS-твин. Высушивают их на фильтровальной бумаге и помещают рядом
с контрольными треками, окрашенными белковым красителем. Полосы можно
приклеить на плотную бумагу.
5.3.3. Технические замечания
1. Разведение антииммуноглобулинов, конъюгированных с ПХ, определяют
эмпирически. Наш опыт показывает, что конъюгат служит основной причиной
неспецифического окрашивания, поэтому рекомендуется использовать его в
наименьшей концентрации, которая еще обеспечивает достаточно интенсивное
положительное окрашивание. Кроме того, на этой стадии применяют
Предыдущая << 1 .. 92 93 94 95 96 97 < 98 > 99 100 101 102 103 104 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed