Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка):
Чувствительность метода поднимается двояко. Во-первых, это возможность по
данной калибровочной кривой уловить различия в концентрациях образцов.
Результат зависит от того, с какой ошибкой найдены точки кривой, а также
от ее наклона и линейности. Во-вторых, чувствительность определяется
минимальным количеством антигена или антител, которое можно определить
данным методом. В РИД этот параметр зависит от размера лунок, случайных
ошибок, а также от того, насколько видимыми и четкими получились кольца
преципитации при небольших концентрациях образцов.
3.2.6. Преимуществе и иедоствтки рвдиальиой иммуиодиффузии
Метод РИД прост, требует минимального оборудования и дает легко
стандартизируемые результаты как для антигенов, так и для антител. По
сравнению с гемагглютинацией и методами иммуноферментного анализа (гл. 7
и кн. 2) чувствительность РИД невелика (около 5 мкг/мл), однако это
удобный и распространенный метод определения многих антигенов,
концентрация которых удовлетворяет пределам чувствительности. Как для
РИД, так и для ОРИД необходимо иметь моноспецифичеокие преципитирующие
антисыворотки, однако стандартные и опытные образцы антигенов не
обязательно должны быть очищены. Методом РИД невозможно определить
изменения свойств антигена (структуры, целостности эпитопов,
гомогенности), но зато антигенные тесты не подвержены" влиянию pi
(сравните с ракетным и двумерным ИЭФ, см. разд. 4). Помимо низкой
чувствительности метода, главный недостаток РИД - это время, необходимое
для получения количественных результатов. Пластины, на которых поставлена
РИД, удобны для хранения.
4. Иммуноэлектрофоретические методы
В данных методах совмещены электрофоретическая миграция антигенов в
агарозе с последующей иммунопреципитацией в геле. В результате первого
процесса происходит частичное разделение смеси антигенов, поскольку
скорость их миграции в геле зависит от суммарного заряда при данном pH
буферного раствора. Кроме того, отрицательно заряженные молекулы быстро
мигрируют в гель, содержащий антитела, что ускоряет преципитацию и сводит
к минимуму латеральную диффузию.
216
Глава 6
Известны четыре широко распространенных модификации иммуноэлектрофореза.
Они незаменимы для качественного и (или) количественного определения
антигенов (как индивидуальных, так и находящихся в смеси) и значительно
облегчают определение специфичности антисывороток.
4.1. Иммуноэлектрофорез (ИЭФ)
4.1.1. Принцип метода
В пластине агарозного геля вырезают лунки и расположенные между ними
канавки (рис. 6.10). В лунки вносят растворы антигенов и накладывают на
агарозу с противоположных сто-- + рон фитили, соединяющие ее
с электродным буфером в двух резервуарах. После включения тока антигены
начинают мигрировать из лунок вдоль геля и разделяются. По окончании
электрофореза в канавки, параллельные направлению миграции антигенов,
вносят антисыворотки. Антигены и антисыворотки диффундируют в геле
навстречу друг другу, и в месте их взаимодействия образуются дуги
преципитации (рис. 6.11). Идентичность антигенов можно определить,
используя известные антигены и антитела (рис. 6.1.2,А). Принцип
интерпретации результатов такой же, как и для методов диффузии в геле.
Рис. 6.10. Трафарет для лунок и канавок в случае проведения
иммуноэлектрофореза на пластине 8X8 см. Показано расположение лунок для
агарозы с низкой величиной электроэндосмоса, когда большинство антигенов
мигрирует к аноду (например, белки сыворотки). При использовании гелей с
высокой величиной электроэндосмоса для одновременного исследования
"анодных" и "катодных" антигенов, луики можно сместить к центру пластины
4.1.2. Применение
Иммуноэлектрофорез в пер-
вую очередь представляет собой качественный метод исследования антигенов
и специфичности антител.
I. Антигены. Метод применяется для 1) определения антигенного состава
смеси - это, в частности, важно при очистке антигенов, поскольку
позволяет определить природу примесей, и 2) для анализа гетерогенности и
гомогенности индивидуальных антигенов. Он является "краеугольным камнем"
клиниче-
Иммунодиффузия, ИЭФ, иммунохимическое окрашивание 217
Рис. 6.11. Иммуноэлектрофореграмма сыворотки морской свинки, полученная с
помощью полиспецифической кроличьей антисыворотки (агар с высокой
величиной электроэидосмоса)
ского анализа парапротеинов (рис. 6.12, Б) и стандартным методом
иммунохимического анализа широкого спектра белков 01]. Метод широко
применяется при исследовании антигенов инфекционных агентов, белков
плазмы и других физиологических жидкостей человека и животных. Он
эффективно используется для первичного скрининга при исследовании
недостаточности иммуноглобулинов и комплемента.
II. Антитела. Обычный тест на определение специфичности антисывороток
(рис. 6.12,Л). В качестве контроля эффективны антисыворотки против
суммарного пула сывороточных белков.
4.1.3. Воспроизведение метода
1. Готовят агарозные пластины, так же .как для теста диффузии в геле
