Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка):
диэтилбарбитуровая кислота) растворяют в трех литрах дистиллированной
воды. Добавляют 51,54 г барбитурата натрия. Перемешивают, после
растворения, добавляют 5 г азида натрия и доводят объем до 5 литров.
Фосфатный буферный раствор (PBS) pH 7,2.
растворяют в 1 л дистиллированной воды.
Na2HP04-12H20 -2,7 г NaH2P04-2H20 -0,39 г NaCl - 9,0 г
2С0
Глава 6
Рис. 6.1. Оборудование для методов иммуиодиффузии в геле и ИЭФ *'
Изотонический [0,85-ный % (вес на объем)] раствор NaCl в дистилированной
воде.
Растворы для окрашивания белков и отмывания геля:
1. Смешивают дистиллированную воду, ледяную уксусную кислоту и метанол в
соотношении 5:1:5, общий объем - 2,5 л.
2. К одному литру раствора добавляют 5 г красителя ку-масси
бриллиантового синего R (окрашивающий раствор).
3. Оставшиеся 1,5 литра - раствор для отмывания.
Полиэтиленгликоль (ПЭГ) (мол. масса 6000).
Бромфеноловый синий кристаллический.
Стандартные растворы антигенов в концентрации 1 мг/мл (индивидуальные
антигены). В некоторых тестах для исследования сывороточных белков можно
использовать пул нормальных сывороток. Для исследования сывороточных
белков человека его целесообразно откалибровать по стандарту ВОЗ с
известными концентрациями компонентов (см. приложение) .
Контрольные антисыворотки - моно- или лолислецифиче-ские в зависимости от
модификации теста (список фирм, поставляющих оборудование и материалы,
см. в приложении).
Иммуиодиффузия, ИЭФ, иммуиохимическое окрашивание_____________201
2.4. Приготовление 1 %-ного (вес на объем) агарозно-барбиталового геля
1. В двухлитровую коническую колбу наливают 500 мл горячего барбиталового
буфера, добавляют 5 г сухой агарозы и перемешивают на магнитной мешалке с
подогревом до растворения.
2. После полного растворения агарозы (раствор должен быть прозрачным)
добавляют 15 г ПЭГ и продолжают перемешивать, пока он не растворится.
3. Разливают раствор во флаконы с крышками по 20-40 мл и хранят при 4°С.
Для иммунодиффузии и некоторых модификаций ИЭФ вместо агарозы можно
использовать агар (см. разд. 4.1.4, п. 2). Для этого готовят 1,0-1,5%-ный
(вес на объем) раствор агара в PBS или 0,85%-ном растворе NaCl с 3% ПЭГ.
Однако удобнее приготовить стандартный агарозный гель, который можно
использовать при осуществлении любого метода. Агароза хорошо растворима,
легкоплавка, не застывает при 56 °С, а при охлаждении быстро превращается
в прозрачный гель, обладающий при концентрации 1 % достаточной
прочностью. Подвижность крупных молекул зависит от концентрации геля.
3. Методы диффузии в геле
Два метода, описанные в этом разделе, основаны на пассивной диффузии
антител и антигена в толще геля. Первый метод - качественный и
используется для определения специфичности антигенов и антител; второй -
полуколичественный и позволяет определять как антигены, так и антитела в
моно-специфичных оистемах.
3.1. Двойная диффузия в геле (ДДГ)
3.1.1. Принцип метода
Растворы антигенов и антител помещают в противоположные лунки глубиной
около 1,5 мм, вырезанные в горизонтально расположенном агаровом или
агарозном геле. Расположение лунок и расстояния между ,ними определяют по
трафарету, подложенному под стекло. Это позволяет стандартизировать
эксперименты. Антигены и антитела диффундируют в гель, встречаются друг с
другом и образуют полосы преципитации между противоположными лунками.
Время, необходимое для преципитации, определяется в основном расстоянием
между лунками с антигенами и антителами. В целом расстояние меж^' ду
лунками не должно превышать 6 мм. Если все лунки одина-
202
Глава 6
нового размера, расстояние между ними не должно превышать двух диаметров
лунки. При исследовании больших молекул (мол. масса >106, например IgM),
которые диффундируют медленно, образование преципитатов занимает более 24
ч. Обычно достаточно инкубации в течение ночи при 4°С. При повышении
температуры реакция идет быстрее, но иногда при этом ухудшается
разрешение. Можно подобрать размеры лунок таким образом, чтобы
соотношение реагирующих веществ было оптимальным, а полосы преципитации -
четкими. Если относительные концентрации подобраны плохо, иммунные
комплексы останутся растворимыми и линии преципитации либо не будут видны
совсем, либо же получатся нечеткими и размытыми. Наилучшие результаты
получают при использовании нескольких концентраций (раз-ведений)
антигенов и антител. В случае неразведенных антисывороток концентрация
антигенов, как правило, должна составлять около 1 мг/мл. Используя
антисыворотки с хорошими преципитирующими свойствами в соответствующих
разведениях, можно определить индивидуальные антигены в концентрации 5
мкг/мл. На рис. 6.2 приведены примеры расположения лунок, которые могут
оказаться полезными. Размеры лунок даны с учетом масштаба. Известны
коммерческие перфораторы для вырезания луиок, расположенных определенным
образом относительно друг друга (см. приложение).
3.1.2. Применение метода
1. Важный первичный тест на преципитирующие свойства, приблизительный
