Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 86

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 80 81 82 83 84 85 < 86 > 87 88 89 90 91 92 .. 122 >> Следующая

титр и специфичность антисывороток к растворимым антигенам.
2. Стандартный способ определения специфичности антисывороток.
3. Тест на .идентичность антигенов, определение чистоты антигена и
антигенных взаимосвязей между молекулами.
4. Приблизительное определение концентрации антигена.
Рис. 6.2. Трафарет для реакций ДДГ. Расположение лунок можно изменять в
зависимости от условий конкретного эксперимента
Иммуиодиффузия, ИЭФ, иммунохимическое окрашивание_____________203
3.1.3. Приготовление гелей
1. Открывают крышку флакона, в котором хранится агароза, и помещают
флакон в кипящую воду до полного расплавления агарозы.
2. При использовании подложки Gelbond увлажняют пленку и прикладывают ее
несмачиваемой стороной к стеклянной пластине. Помещают пластину на столик
с уровнем или на рабочий стол и убеждаются в том, что она расположена
горизонтально.
3. Наносят на пластину 9,6 мл расплавленной агарозы, которая растекается
по пластине от центра к краям (при необходимости помогают агарозе
растечься с помощью наконечника пипетки и убеждаются, что в геле не
осталось пузырей). Образование неровного и мутного геля свидетельствует о
том, что агароза была недостаточно горячей.
4. Дают гелю застыть, затем помещают пластину на трафарет и вырезают
лунки. Ненужные кусочки геля отсасывают или удаляют с помощью
остроконечного скальпеля или иглы для подкожных инъекций (можно
использовать и маленький крючок).
3.1.4. Постановка реакции
1. Иопользуя микропипешу с тонким наконечником, вносят: в лунки антигены
и антитела. Соблюдают осторожность, чтобы не повредить гель и не
переполнить лунки. Лунки должны быть заполнены практически полностью, для
этого надо правильно подобрать их размеры.
2. Помещают гель в кювету на влажную фильтровальную бумагу и закрывают
крышкой. Никогда не оставляют гели открытыми, поскольку они быстро
высыхают. Можно проводить реакцию при комнатной температуре, однако, если
необходима инкубация в течение ночи, лучше проводить ее при 4°С. За гелем
следует периодически наблюдать. Интенсивная преципитация может произойти
уже через несколько часов. При образовании хорошо видимых линий
преципитации (время инкубации - до 24 ч) гель отмывают, чтобы остановить
реакцию, высушивают и окрашивают.
3. Погружают гель в кювету, заполненную 0,85%-ным раствором NaCl, и
вымачивают в течение нескольких часов (лучше в течение ночи). Используют
пленку Gelbond, чтобы предотвратить отделение геля от подложки. Заменяют
раствор NaCl на дистиллированную воду, вымачивают гель несколько. часов и
затем извлекают его из кюветы. ' .
204
Глава 6
4. Для высушивания геля на него помещают смоченную водой фильтровальную
бумагу, а поверх нее - несколько слоев бумажных салфеток. Сверху помещают
книгу или что-либо аналогичного веса (примерно 1 кг). Через 2 ч снимают
груз и мокрые салфетки. Фильтровальную бумагу оставляют - она должна
высохнуть сама. Для ускорения высыхания геля можно использовать фен.
Сухая бумага легко отделяется от гладкой тонкой пленки высохшего агара.
Подложку Gelbond на этой стадии можно снять со стекла вместе с высохшим
гелем.
5. Для окрашивания гель, находящийся на стекле или подложке, помещают в
краситель кумасси синий R примерно на 1 мин. Целесообразно использовать
прозрачную кювету с подсветкой, чтобы наблюдать за развитием окраски.
После окрашивания сливают краситель обратно во флакон и промывают
пластину под струей воды. Помещают пластину в раствор для отмывания,
чтобы устранить фоновое окрашивание, вновь промывают и высушивают. Гели
на подложках Gelbond удобно хранить в альбоме. Стеклянные пластины с
гелями хранят вертикально в стопках или в коробках, закрытых пленкой.
3.1.5. Интерпретация результатов
I. Важность сбалансированных эквивалентных концентраций - использование
разных соотношений антиген : антитело. На рис. 6.3 видно, как различия в
концентрации антигена (внешние лунки, IgG человека) влияют на
расположение линий преципитации при взаимодействии с антителами
(центральная лунка, антисыворотка к IgG человека) и "а разрешающую
способность теста. Это еще раз подтверждает, что при тестировании как
антисывороток, так и антигенов следует использовать реагенты в различной
концентрации. В множественных преципитирующих системах все антигены и
антитела не удается выявить при каком-либо одном разведении реагентов.
Целесообразно использовать несколько разведений при (Первичном
определении преципитирующих свойств и титров сывороток, когда
концентрация антигена неизменна. Хорошая антисыворотка дает четкую полосу
преципитации посередине между лунками с антигенами и антителами в
разведении более чем 1 : 50.
II. Множественные системы антиген: антитело и определение чистоты
антигена. Рис. 6.4 иллюстрирует результаты взаимодействия
полиспецифической антисыворотки (центральная лунка) с раствором смеси
антигенов и с антигеном возрастающей степени очистки. Непрерывные линии
преципитации между лункой с антителами и внешними лунками свидетельствуют
Предыдущая << 1 .. 80 81 82 83 84 85 < 86 > 87 88 89 90 91 92 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed