Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 90

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 84 85 86 87 88 89 < 90 > 91 92 93 94 95 96 .. 122 >> Следующая

I. Измерение колец преципитации на влажных и окрашенных пластинах. Во
многих случаях можно считывать результаты с еще -влажных гелей. Измерение
проводят с помощью окулярного 'микрометра, прикладываемого к обратной
стороне пластины. Пластину рассматривают на темном фоне при косом
освещении. Существуют коммерческие модели ридеров с источником
рассеянного света и линзой с координатной сеткой.
Прежде чем измерять кольца преципитации, пластины можно высушить и
окрасить, как и в случае ДДГ (разд. 3.1.4). Высушивание следует проводить
осторожно, чтобы кольца преципитации не изменили формы и размеров.
Высушенные пластины можно измерять с -помощью окулярного микрометра или
специальных линеек, которые поставляются некоторыми производителями
готовых пластин для РИД.
II. Калибровочные кривые. Диаметр колец находится в линейной зависимости
от концентрации антигена только в том случае, если реакция 'продолжалась
несколько дней и закончилась полностью. Если результаты учитывают через
24 ч после начала реакции, можно предложить в качестве компромисса
построить график зависимости диаметра колец от логарифма концентрации
антигена. Данный метод дает хорошее спрямление калибровочной кривой (рис.
6.8,Л). Однако более популярны другие методы. Можно, например, построить
график зависимости квадратов диаметра колец (в линейных координатах) от
двукратных разведений стандарта (рис. 6.8, В) или от убывающих
концентраций антигена (рис. 6.8,Б). Все три метода дают одинаково точные
значения для опытных образцов.
На рис. 6.8 приведены графики зависимости диаметра колец преципитации от
концентрации стандартно^ IgG человека. Измерения проводили через 16, 24,
36 и 48 ч после начала экспериментов по выявлению IgG в сыворотках
человека На рис. 6.9 показана пластина, на которой был поставлен этот
тест. Условия опыта указаны в подписи к рисунку. Пример исследования
антисывороток барана к IgG человека методом ОРИД -показан на рис. 2.8,
гл. 2.
III. Точность, разрешающая способность и чувствительность. Точность или
воспроизводимость результатов радиальной диффузии сильно повышается, если
использовать внутренние стандарты. Тогда случайные ошибки сводятся к
разбросам в пределах пластины, главными причинами которых служат
неточность разведения и нанесения образцов. По мере накопления опыта
можно добиться таких результатов, когда
Иммунодиффузия, ИЭФ, иммунохимическое окрашивание 213
Логарифм концентрации антигена (IgG) , ед. Разведение антигена
(сывороточный |gG)
Антиген (IgG) , ед.
Рис. 6.8. Три способа построения калибровочных кривых по одним н тем же
данным для определения антигена методом РИД. Кривые на каждом графике
отражают реальные диаметры колец преципитации в опыте с IgG человека,
измеренные через 16, 24, 36 и 48 ч. Обратите внимание, что наилучшая
линейность кривой достигается при использовании метода, который
иллюстрирует рис. В, однако для этого необходима инкубация в течение 48
ч. Кривые (16-часовая инкубация), построенные при использовании методов А
и Б, обеспечивают достаточную точность. Пластина РИД, с которой сняты
данные для построения кривых, приведена иа рис. 6.9. Условия опыта
указаны в подписи к этому рисунку
214 Глава 6
Рис. 6.9. Реакция РИД для определения концентраций IgG в сыворотке-
человека. К агарозе (9,6 мл) добавили 100 мкл IgG-фракцнн антител барана
к IgG человека (Fc-специфические антитела). Для построения калибровочной
кривой использовали пул нормальных человеческих сывороток (с известной
концентрацией IgG) в разведениях 1 : 10, 1: 20, 1 : 40, 1: 80 и 1 : 160.
Каждое разведение вносили в две лунки, выбранные случайным образом.
Опытные образцы, в частности сыворотки больных IgG-миеломой, разводили в
50 и 100 раз и каждое разведение вносили в две луики. Пластину
инкубировали 48 ч при комнатной температуре
ошибка будет составлять не более 5%. Ошибку .можно определить, измерив
разброс диаметров колец преципитации вокруг параллельных лунок. Кроме
того, ошибки проявляются в нерегулярности полученной калибровочной
кривой. Для уменьшения ошибки и приближения результатов к реальным
значениям, желательно подбирать разведения таким образом, чтобы значения,
полученные для опытных образцов, попадали на середину калибровочной
кривой. Из двух разведений образца для определения его концентрации
следует выбирать то, которое дало результат, лежащий ближе к центру
калибровочной кривой, чем и объясняется необходимость использования двух
разведений. Точность определения варьирует от разведения к разведению из-
за разного наклона кривой. Если результаты ни для одного из разведений
опытного образца не попадают в центр калибровочной кривой, опыт лучше
повторить с другими разведениями. Точность увеличивается и в
Иммунодиффузия, ИЭФ, иммунохимическое окрашивание 215
там случае, если 'все разведения всех образцов вносят в параллелях (это
снизит эффект случайных ошибок), и увеличивают количество точек
калибровки, приблизив их друг к другу.
Предыдущая << 1 .. 84 85 86 87 88 89 < 90 > 91 92 93 94 95 96 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed