Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 74

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 68 69 70 71 72 73 < 74 > 75 76 77 78 79 80 .. 122 >> Следующая

При этом ключевым параметром иммуносорбции становится аффинность
моновалентного взаимодействия [17]. Благодаря высокой концентрации МКА,
присоединенных к гелю, связывание антигена, как правило, происходит
достаточно быстро, и лишь в исключительных случаях кинетические параметры
иммуносорбции требуют скорости потока меньшей, чем обычно используемая -
один объем колонки в час. Выявление МКА обычно основано на поливалентном
связывании с антигеном (см. рис. 5.1), в котором участвуют как низко-,
так и высокоаффинные антитела. Однако для аффинной хроматографии
требуются антитела, обеспечивающие моновалентное связывание. Поэтому
среди имеющихся МКА необходимо провести дополнительный отбор препаратов,
обладающих нужной аффинностью. Это можно сделать, например, по
способности МКА вызывать иммунопреципитацию антигена или по торможению
растворимым (одновалентным) антигеном связывания с поливалентным
антигеном, иммобилизованным на поверхности клеток или пластиковых панелей
[17]. На рис. 5.2 схематично изображены взаимодействия, возможные при
реакции торможения. Очевидно, торможение происходит лишь в том случае,
если время диссоциации 50% моновалентных связей примерно равно или
превышает время проведения самого анализа. Антитела, у которых t./,
составляет более 10 мин,
172
Глава 5
Преинкубацин Определение
¦ несвязавшихся антител
Связывание
блокировано
Рис. 5.2. Зависимость подавления связывания антител с моно- или
поливалентным антигеном определяется скоростью диссоциации иммунных
комплексов
обычно имеют аффинность к белковым антигенам выше 108М-1, что достаточно
для аффинной хроматографии [18].
Для того чтобы выделить высокоаффинные МКА, лучше Всего получать В-клетки
от гипериммунизированных животных, дающих сильный вторичный иммунный
ответ с преобладанием высокоаффинных IgG. Применение же IgM в аффинной
хроматографии, насколько нам известно, никогда не' было успешным.
поливалентным
мембранный
антиген
i-за бивалентного I * связывания
диссоциация комплекса происходит медленно
Поливалентный антиген на поверхности клетки-мишени
И'ммуноаффинная хроматография
173
Однако использование чрезмерно аффинных антител, по-видимому,
нецелесообразно, поскольку может быть затруднена злюция связанного
антигена. Правда, аффинность в диссоциирующих условиях необязательно
коррелирует с аффинностью в физиологических условиях (т. е. при
связывании). Поэтому в любом случае аффинность должна быть достаточно
высокой для того, чтобы антиген эффективно задерживался колонкой во время
нанесения на нее антигенсодержащего экстракта и при отмывании.
Применяя МКА к антигенам клеточной поверхности, необходимо учитывать, к
каким детерминантам - белковым или углеводным - они специфичны. Каждый
антиген обычно имеет уникальные белковые детерминанты, но даже в тех
случаях, когда существует перекрестная реактивность с посторонними
молекулами, аффинность антител к ним будет слишком низка, чтобы вызвать
какие-либо затруднения. Углеводные же детерминанты, наоборот, часто
бывают одинаковы у целого ряда гликопротеинов и гликолипидов, поэтому с
помощью антител к углеводным частям антигенов клеточной поверхности
нельзя добиться нужной степени очистки. Правда, при использовании МКА к
гликопротеинам млекопитающих эта проблема не возникает. Среди таких МКА
преобладают антитела к белковым детерминантам, возможно, потому что
большинство углеводных структур многих видов млекопитающих весьма сходны
друг с другом и поэтому не вызывают иммунного ответа у иммунизируемого
животного. Однако в природе встречаются и чрезвычайно иммуногенные
углеводы. Например, большинство МКА к гликопротеину миксомицет
связываются с углеводной детерминантой. общей для множества различных
мембранных молекул [19].
4.2. Выделение моноклональных IgG
Мы выделяем МКА класса G из асцитной жидкости, содержащей обычно более 2
мг/мл антител. Используется метод, применяемый для фракционирования
мышиной сыворотки (см. разд. 3.1), но при этом обе стадии высаливания
проводят, добавляя Na2S04 до 18% (по весу), и исключают гель-фильтрацию.
В ходе очистки необходимо контролировать активность МКА, снижение которой
может происходить на стадиях высаливания и ионообменной хроматографии на
ДЭАЭ-целлюлозе. Иногда концентрацию Na2S04 необходимо увеличить до 20%.
Кроме того, случается, что некоторые образцы МКА остаются связанными с
ДЭАЭ-целлюлозой даже в буфере трис/50 мМ NaCl. В этом случае их можно
элюировать с колонки буфером, содержащим 75 мМ NaCl. Для многих целей
можно использо-
174
Глава 5
вать полуочищенные МКА класса G, полученные лишь путем осаждения Na2S04.
Однако, чтобы достичь максимальной емкости колонки, следует использовать
IgG, очищенный на ДЭАЭ-целлюлозе. Если при реклонировании гибридомы
достигается образование антител во всех лунках, примесь нормального IgG,
в препарате МКА обычно не превышает 10%. Перед иммобилизацией мы доводим
концентрацию IgG до 10 мг/мл и диализу-ем против боратного (0,05 М
Предыдущая << 1 .. 68 69 70 71 72 73 < 74 > 75 76 77 78 79 80 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed