Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 71

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 65 66 67 68 69 70 < 71 > 72 73 74 75 76 77 .. 122 >> Следующая

16. Kozbor D., Roder J. C. J. Immunol., 127, 1275 (1981).
ГЛАВА 5
ИММУНОАФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ
Ж. Арвье и А. Ф. Уильямс
1. Введение
Очистка поликлональных антител путем специфического связывания с
нерастворимым антигеном всесторонне разрабатывалась как один из видов
аффинной хроматографии [1] и вошла в широкую практику после открытия
бромциановой активации, позволяющей присоединять содержащие аминогруппы
лиганды к гранулированной полисахаридной матрице, в частности к агарозной
[2, 3].
Несмотря на сравнительную простоту аффинной очистки антител, обратная
процедура, а именно очистка антигена на колонке с иммобилизованными
антителами, была, как правило, неэффективной. Дело в том, что для
получения специфической антисыворотки обычно требуется чистый антиген, а
его легче очистить традиционными методами, чем при помощи колонки с
иммобилизованными специфическими поликлональными иммуноглобулинами. Одна
из причин неэффективности колоночной очистки в данном случае заключалась
в том, что специфические антитела составляют весьма незначительную долю
всех иммобилизованных иммуноглобулинов.
Колонки с иммобилизованными поликлональными антителами, выделенными из
сыворотки продуцентов, иммунизированных частично очищенным антигеном, все
же оказывались полезными в ряде случаев. С помощью таких колонок удалось
увеличить степень очистки некоторых вирусных ферментов [4] и интерферона
человека [5], они использовались для первичной очистки антигенов
клеточной поверхности Thy-1 и HLA. Тимо-цитарный антиген Thy-1 был
аффинно очищен на колонке с антителами к полуочищенному мозговому Thy-1
[6], а нативная димерная форма HLA была выделена с помощью
иммобилизованных антител к §2-2-микроглобулину, который представляет
собой легкую цепь этого димера и может быть в свою очередь получен из
мочи при патологии почек [7].
Проще всего использовать колонки с иммобилизованными поликлональными
антителами для очистки антигена от незначительных примесей, если эти
примеси не ассоциированы с его молекулами [8]. Можно использовать
специфическую антисыворотку с высоким содержанием антител к примесям или
вы-
Иммуноаффинная хроматография
165
делить из нее чистые антитела, а емкость колонки, как правило, будет
достаточной, поскольку количество вещества, от которого надо избавиться,
очень мало.
Проблема получения специфических антител при отсутствии чистого антигена
была решена с разработкой технологии получения моноклональных антител
(МКА) [9], позволяющей выделять антитела к индивидуальным компонентам
любой сложной смеси антигенов [10]. Очень скоро МКА были использованы в
аффинной хроматографии - вначале для очистки антигенов клеточной
поверхности [11, 12], а затем для выделения множества других белков [13,
14].
Помимо высокой специфичности МКА имеют еще два существенных отличия от
поликлональных антител.
1. В препарате МКА (даже в виде асцитной жидкости) фактически все
молекулы иммуноглобулина представляют собой антитела нужной специфичности
в отличие от препарата поликлональных антител, в котором самое большее
20% молекул иммуноглобулина, а зачастую и намного меньше имеют
необходимую специфичность. Это значит, что, используя МКА, можно
приготовить аффинные колонки очень высокой емкости, пусть даже не
достигающие теоретически возможной (см. ниже).
2. Каждый образец МКА обладает уникальными характеристиками кинетики и
прочности связывания с антигеном и, как правило, распознает только одну
его детерминанту.
Разнообразием индивидуальных свойств, которыми обладают МКА, можно
воспользоваться, например, для выбора образца, обладающего нужными
характеристиками (хотя, к сожалению, изредка встречаются образцы МКА с
непригодными свойствами) .
Монодетерминантное связывание МКА по сравнению с по-лидетерминантным
создает лучшие условия для элюции антигена, связанного с колонкой.
Правда, и при работе с поликлональными антителами в большинстве случаев
каждая специфически связывающая молекула иммуноглобулина фиксирована на
носителе колонки в окружении неактивных молекул, поэтому связывания более
чем с одной детерминантой, как правило, не происходит.
На практике колонки с достаточно аффинными МКА всегда можно с пользой
применить для очистки антигена, в то время как колонки с поликлональными
антителами нередко для этого непригодны. На наш взгляд, основная причина
широкого применения иммобилизованных МКА для аффинной очистки - это
возможность их получения в препаративных количествах, иммунизируя
продуцентов неочищенными антигенами.
В настоящей главе мы, во-первых, опишем методы очистки кроличьих
поликлональных антител к мышиным и крысиным
166
Глава 5
Ig. Эти реагенты используются в серологических реакциях в качестве вторых
антител для выявления связанных с антигенами МКА. Во-вторых, мы обсудим
аффинную хроматографию с использованием МКА. Поскольку все частные
приложения данного метода рассмотреть невозможно, мы сосредоточим
внимание на принципах и схемах выделения антигенов клеточной поверхности
Предыдущая << 1 .. 65 66 67 68 69 70 < 71 > 72 73 74 75 76 77 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed