Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка):
N2B407/HC1) буфера, pH 8,0.
4.3. Присоединение моноклональных антител к гранулам геля агарозы
Внимание! Бромистый циан - ядовитое и летучее вещество!
Для присоединения антител к гранулам агарозы фирмы Pharmacia (Швеция) мы,
как правило, используем бромистый циан (CNBr). Другие методы
иммобилизации описаны в многочисленных руководствах, например [20]. Можно
воспользоваться коммерческими гелями, уже активированными бромцианом, и
вести присоединение по инструкции изготовителя. Однако осуществление
метода Пората [21] собственными руками представляется нам наиболее
простым, воспроизводимым и экономичным подходом. Раньше мы использовали
сефарозы 2В, 4В и CL-4B фирмы Pharmacia. Но в настоящее время применяем
лишь сефарозу CL-4B. В литературе описан метод иммобилизации МКА на
протеин А-сефарозе 4В с последующей фиксацией глутаровым альдегидом [22].
Однако при иммобилизации антител спейсерная группа, функцию которой
выполняет протеин А, не нужна. Связалась ли молекула антитела с носителем
через. Fc-фрагмент или через один из Fab-фрагментов, в любом случае по
крайней мере один Fab-фрагмент останется свободным для связывания
антигена. Расчеты показывают, что сорбент, получаемый при использовании
протеин А-сефарозы 4В [22], по емкости не превосходит сорбенты,
полученные прямым присоединением антител. В некоторых случаях, однако,
присоединение через протеин А имеет существенные преимущества.
Обычно присоединяют 5-10 мг антител на миллилитр набухшего геля при
минимальной концентрации CNBr, обеспечивающей полную сшивку. Для
получения стабильных результатов необходимо использовать CNBr хорошего
качества. Мы расфасовываем в вытяжном шкафу каждую новую упаковку,
содержащую 25 г, в 16 предварительно взвешенных стеклянных флаконов
объемом 5 мл с завинчивающимися крышками и затем взвешиваем их, чтобы
определить количество CNBr в каждом флаконе. После этого флаконы
помещаются в контейнер с влагопоглотителем. Контейнер помечают
предупреждающей
Иммупоаффинная хроматография
175
надписью, тщательно герметизируют, закрыв крышкой и заклеив лентой, и
хранят при температуре -20°. Перед использованием контейнер помещают в
вытяжной шкаф, чтобы он нагрелся до комнатной температуры, и извлекают из
него порцию CNBr. Необходимо, чтобы на протяжении всего времени работы с
CNBr он находился в герметичном контейнере под тягой.
Ниже приведено поэтапное описание присоединения антител к гранулам геля.
Этапы 2-6 проводят в вытяжном шкафу.
1. Сефарозу отмывают водой и определяют объем осадка гранул геля после
центрифугирования при 500g в течение 5 мин в градуированной центрифужной
пробирке.
2. Помещают 1 объем геля и 0,5 объема воды в стакан, вмещающий 5 объемов.
Стакан ставят на ледяную баню, находящуюся на магнитной мешалке и
помещают в него магнит. Непосредственно перед внесением CNBr к гелю
добавляют 1 объем ледяного 4М КгНРСЬ/КОН-буфера, pH 11,5.
3. Берут CNBr (из расчета 30 мг на 1 мл осадка гранул геля сефарозы 4В
или 40 мг на 1 мл сефарозы CL-4B) и растворяют в диметилформамиде до
концентрации 300 мг/мл, а затем добавляют в течение 1 мин к
перемешиваемым гранулам геля. Перемешивание продолжают еще 9 мин.
4. После этого взвесь гранул геля быстро переносят в воронку с фильтром
из микропористого стекла и удаляют фильтрат с помощью водоструйного
насоса. Затем промывают гель 4-5 раз пятью объемами ледяной воды, каждый
раз полностью отсасывая жидкость.
5. Гранулы геля переносят в раствор IgG на 0,05 М борат-ном (Na2B40r/HCl)
буфере, pH 8, поместив в пластиковую пробирку с завинчивающейся крышкой
или в центрифужный стакан (гель должен впитать почти весь объем жидкости)
и медленно вращают пробирку при 4°С в течение 2 ч или встряхивают ее
каждые 10 мин. Затем оставляют гель при 4°С на ночь.
6. Всю использованную посуду замачивают в коммерческом растворе
отбеливателя для нейтрализации CNBr и затем промывают большим количеством
воды.
7. На следующее утро центрифугируют гранулы геля при 500 g в течение 5
мин и измеряют поглощение супернатанта при 280 нм, чтобы определить
количество несвязавшегося IgG.
В нашей практике эффективность связывания обычно превышает 90%. Гранулы
геля после присоединения отмывают на воронке с фильтром буфером трис/150
мМ NaCl и оставляют на 10 мин в 50 мМ HCl-этаноламиновом буфере, pH 8,
чтобы заблокировать оставшиеся активные группы. Гель хранят в указанном
выше трис-буфере при 4°С.
176
Глава 5
Высота, на которой расположен резервуар, определяется требуемой скоростью
протока
Эластичный шланг
Обрезанный наконечник пипетки
Силиконовые пробк
Шланг подачи должен образовывать петлю, находящуюся ниже уровня выхода из
колонки, чтобы исключить возможность ее высыхания
Рис. 5.3. Устройство системы аффиииых колонок
8. Перед тем как проводить хроматографию, проводят элю-цию колонки
буфером, который затем будет использован для диссоциации комплексов
антиген - антитело.
4.4. Аффинные колонки и скорость хроматографии
