Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 79

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 73 74 75 76 77 78 < 79 > 80 81 82 83 84 85 .. 122 >> Следующая

активности в расчете на белок, однако данный метод анализа вполне
пригоден для определения сорбции и выхода антигена в процессе аффинной
хроматографии.
5.2. Приготовление клеточных экстрактов
5.2.1. Получение ткани
В первую очередь следует обратить внимание на то, что для эффективной
очистки требуется располагать достаточным количеством ткани. На рис. 5.4
приведены приблизительные количества материала, необходимые для различных
целей. Если, например, выделяемый антиген имеет мол. массу 50000 и
представлен в количестве 5-104 молекул на клетку, для получения 0,5 мг
(10 нмоль) чистого гликопротеина необходимо иметь 6-10" клеток (при
предполагаемом выходе 10%). Такое количество клеток можно выделить из
тимусов не менее 200 крыс. Для выделения этого же иммуноглобулина из
нелимфоидной ткани требуется гораздо большее количество животных.
5.2.2. Свойстве детергентов
В табл. 5.1 приведены свойства некоторых детергентов, использующихся для
солюбилизации антигенов. Подходящий детергент обычно удаляет липиды,
связанные с гидрофобными доменами, не денатурируя при этом остальные
участки белка [37]. Детергенты добавляют в соотношении 10:1 по весу
белка.
Ниже приведены некоторые аспекты использования различных типов
детергентов.
Иммуноаффинная хроматография
185
А
а> 3
I 5 S о
Количество белкового ингибитора связывания
Количество белкового ингибитора связывания в пробе, мкг
Рис. 56. Подавление связывания антител с MRC ОХ-45 различными тканевыми
препаратами. Супернатант тканевой культуры, содержащий антитела,
разводили 1/150 и инкубировали с равным объемом каждого из перечисленных
ниже препаратов. После центрифугирования определяли количество не-
связавшихся антител. Подробности см. в разд. 5.1.3.
А. Для связывания антител использовали тимоциты (черные кружки), го-
могенат селезенки (светлые треугольники), гомогенат мозга (черные
квадраты). Б. Для связывания антител использовали препарат мембран из
клеток селезенки крысы, полученный экстракцией твином-40 (см. разд.
5.2.4, светлые ромбы), и такой же препарат, полученный экстракцией
дезокси-холатом (разд. 5.2.5, черные ромбы)
1. Сильноионные детергенты (например, ДСН). Додецил-сульфат натрия
редко применяется в аффинной хроматографии, поскольку он связывается со
всеми участками белка и вызывает сильную денатурацию. Однако некоторые
антигенные детер-
Таблица 5.1. Свойства детергентов
Критическая концентрация образования мицелл (мм) Связывание
с белком Способность препятствовать взаимодействию антигена с
антителами
Тип детергента Размер миделл (Мг) С большей частью
последовательности С гидрофобными участками Активность при
солюбилизации Прозрачность при 280 нм
Сильноионные
Например ДСН 18 000-36 ООО') 0,5-80 + + + ++ Да
Слабоионные -2)
Например, дезоксихолат 1700 и более') 4-6 + - ++
натрия, холат натрия 900-1800 13-15 - -L - +
Неионные Например, тритон Х-100 90 000 0,24 + +
Her
Brij-96 большие <0,04 + Да
Данные взяты из статьи (37). Приведены показатели для комнатной
температуры.
') Зависит от состава буферного раствора.
2) Возможно незначительное взаимодействие с негидрофобными
последовательностями.
Иммуноаффинная хроматография
187
минанты не зависят от конформации молекулы и в ряде случаев целесообразно
денатурировать белок в ДСН, а затем перед аффинной хроматографией
добавить дезоксихолат или неионный детергент, чтобы сформировались
смешанные мицеллы, и предотвратить таким образом возможное повреждающее
действие ДСН на колонку. Такой подход был использован для разделения двух
цепей крысиного антигена CD8. Вначале с помощью аффинной хроматографии
были очищены связанные дисульфидными мостиками димеры, затем провели
диссоциацию цепей в ДСН, после чего добавили избыток дезоксихолата и
повторили аффинную хроматографию для разделения цепей [38].
II. Слабоионные детергенты. В присутствии дезоксихолата, по-видимому,
происходит наиболее полная солюбилизация мембран, а относительно высокая
критическая концентрация мицеллообразования у этого детергента позволяет
удалять его с помощью диализа. Кроме того, благодаря малому размеру
мицелл связанный детергент не влияет на поведение солюбилизированных
белков во время гель-фильтрации. Мы обычно применяем гель-фильтрацию
после очистки на колонке с МКА для того, чтобы освободиться от
незначительных примесей. Недостаток дезоксихолата заключается в том, что
при pH ниже 8, а также в присутствии солей он превращается в гель. Холат,
в этом смысле, причиняет меньше хлопот, но он и менее эффективен для
солюбилизации. Однако иногда удобно солюбилизировать препарат в
дезоксихолате, а после связывания антигена на колонке заменить его
холатом. При работе с лимфоидной тканью, если предусматривается
солюбилизация солями желчных кислот, необходимо предварительно удалить
клеточные ядра. В противном случае высвобожденная ДНК значительно
увеличит вязкость раствора. Если же антигены выделяют из мозговой ткани,
Предыдущая << 1 .. 73 74 75 76 77 78 < 79 > 80 81 82 83 84 85 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed