Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 76

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 70 71 72 73 74 75 < 76 > 77 78 79 80 81 82 .. 122 >> Следующая

Мы используем простейшие колонки, сделанные из цилиндров стеклянных
шприцев, с подачей элюирующих растворов под действием силы тяжести (см.
рис. 5.3). Из шприцев можно при-
Иммуноаффинная хроматография
177
готовить колонки наиболее часто используемого объема от 1 до 50 мл.
Обычно мы пользуемся колонками объемом 5 мл и больше; они работают без
снижения выхода, если количество нанесенного антигена будет ниже
насыщения. На пути разделяемой смеси перед аффинной колонкой ставят
предохранительную колонку объемом 10-20 мл, заполненную сефарозой CL-4B с
присоединенным бычьим гамма-глобулином. Мы используем эту колонку (хотя
необходимость в ней не доказана), чтобы удалить из разделяемой смеси
любые частицы или молекулы, которые могут связаться с иммуносорбентом
неспецифически. Скорость протока обычно составляет 1-2 объема колонки в
час. Насос лучше не использовать, поскольку сопротивление колонки во
время хроматографии иногда возрастает, что может привести к протечкам в
местах соединения и потере материала. Промывать колонки можно на большей
скорости.
4.5. Бесколоночная иммуносорбция антигена
Для иммуносорбции антигена можно не пропускать экстракт через колонку, а
смешать большой его объем с МКА-сефарозой CL-4B и инкубировать,
перемешивая, в течение ночи при 4°С. Затем гель отделяют от супернатанта
на фильтре из микропористого стекла и помещают в колонку для отмывания и
элюирования антигена. Основное преимущество данного метода состоит в том,
что он позволяет очень быстро выделить антиген из большого объема
экстракта - чтобы пропустить такой объем через колонку, требуется гораздо
больше времени.
4.6. Отмывание
После прохождения экстракта колонку промывают буферным раствором до тех
пор, пока поглощение буфера при 280 нм на выходе из колонки не сравняется
с поглощением буфера на входе. Основное требование к буферу для отмывания
состоит в том, что он не должен элюировать антиген. Однако в ряде случаев
целесообразно вести отмывание в условиях частичной десорбции связанного
белка. Например, при очистке антигенов клеточной поверхности авторы
сначала промывают колонку трис-буфером с добавлением 0,5% дезоксихолата,
а затем точно таким же буфером, содержащим еще и 0,15 М NaCl (последний
раствор готовят непосредственно перед использованием, поскольку
дезоксихолат, оставленный на ночь при 4°С в присутствии NaCl, образует
гель). Чтобы избавиться от примесей в конечном очищенном препарате, можно
использовать для отмывания колонки буферные растворы с более сильными
диссоциирующими свойствами.
12-997
178
Глава 5
4.7. Элюция антигена
Для того чтобы вызвать диссоциацию комплекса антиген - .антитело,
необходимо частично денатурировать антитела. Однако полной денатурации,
которая достигается обработкой 8М гуанидин-HCl или кипячением в ДСН,
обычно не требуется. Это и хорошо, поскольку всегда желательно, чтобы
после элюирования и антиген, и антитела восстановили свою нативную
конформацию. Чаще всего элюция в диссоциирующих условиях используется при
выделении антител, связавшихся с иммобилизованным антигеном. Как правило,
используют следующее:
I. Высокие значения pH. Это один из наиболее эффективных методов. Обычно
применяемый буфер - 50 мМ диэтиламин-НС1, pH 11,5. Он совместим со всеми
детергентами, включая соли желчных кислот [6, 23, 24].
II. Низкие значения pH. Такая элюция широко применяется при очистке
антител [3-5, 23]; используют 0,1 М HCl-глицино-вый буфер, pH 2,2, 0,1 М
нитратный буфер, pH 2,2, 0,5 М раствор пропионовой кислоты, pH 3.
Пропионовая кислота обладает тем преимуществом, что, вызывая диссоциацию
комплекса антиген- антитело благодаря снижению pH, она, кроме того,
ослабляет гидрофобные взаимодействия. При низком pH можно использовать
неионные детергенты, но не соли желчных кислот.
III. Хаотропные агенты. Способностью нарушать белок-бел-ковые
взаимодействия обладают анионы (в порядке убывания эффективности)
SCN~>C104->I->Br->Cl- и катионы Mg2+> >K+>Na+. Например, с помощью 2,5 М
KI или 2,0 М KSCN были эффективно элюированы антитела к Rh с эритроцитов
[25].
IV. Нагревание. Мы обычно проводим элюирование при 4 °С. Известно,
однако, что антитела теряют аффинность при повышении температуры.
Элюирование при температуре выше 37 °С может быть предметом исследования.
V. Гипотонические растворы. Для элюирования фермента щеточной каемки
почек использовали 2 мМ трис-HCl, pH 8[26].
VI. Поверхностно-активные вещества. Комплексы антиген - антитело
диссоциируют при высоких концентрациях этиленгли-коля или
диметилсульфоксида. Можно вызвать диссоциацию комплексов альбумина со
специфическими антителами 60%-ным этиленгликолем при pH 3,5 или 9,5 [27].
VII. Специальные случаи. Иногда особенности взаимодействия антигена с
антителом позволяют проводить элюирование в очень мягких условиях.
Например, описан образец МКА к антигену Н-2, связывающих его в колонке в
присутствии неионного детергента; при этом можно было проводить
Предыдущая << 1 .. 70 71 72 73 74 75 < 76 > 77 78 79 80 81 82 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed