Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 78

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 72 73 74 75 76 77 < 78 > 79 80 81 82 83 84 .. 122 >> Следующая

молекул в элюате относится к антигену.
Чтобы проследить судьбу антигена на всем пути от исходных клеток до
очищенного препарата, мы используем непрямую реакцию торможения
связывания МКА на фиксированных глу-таровым альдегидом клетках-мишенях
[15]. Однако существует и другой подход: на каждой стадии очистки
полученный материал адсорбируют на нитроцеллюлозной мембране и выявляют
содержание- в нем антигена по связыванию МКА непрямым методом [34].
182
Глава 5
5.1.1. Фиксация клеток
(См. также метод анализа с использованием клеток, фиксированных в лунках
панели для микротитрования,[35].)
1. Отмывают соответствующие клетки-мишени (лимфоциты, эритроциты,
лейкозные клетки, клетки лимфобластоидных линий и т. д.) один раз в
буфере DAB, суспендируют их в концентрации 108 клеток/мл и добавляют
равный объем 0,25%-ного глутарового альдегида в DAB. Можно использовать и
го-могенаты тканей [36].
2. После пятиминутной инкубации при 23°С останавливают реакцию, добавив
1/10 объема 10%-ного бычьего сывороточного альбумина (БСА) и отмывают
клетки один раз 0,5%-ным БСА в DAB.
3. Суспендируют клетки в 10%-ном БСА в DAB, пропускают их через иглу от
шприца, чтобы устранить клеточные агломераты, и добавляют 10%-ный БСА в
DAB для доведения концентрации клеток до 5•108 в 1 мл в случае
эритроцитов и до 108 в 1 мл в случае других типов клеток. Клетки можно
хранить несколько лет при -30 °С без потери антигенных свойств.
5.1.2. Оценка связывания антител с клетками непрямым методом
Все стадии проводят при 4°С.
1. В лунки панели для микротитрования с U-образным дном вносят по 2-106
фиксированных клеток-мишеней (20 мкл) и по 5-106 фиксированных
эритроцитов барана (10 мкл), которые необходимы для того, чтобы во время
отмывания осадок был лучше виден. Затем добавляют по 25 мкл серийных
разведений антител (в DAB/0,5% БСА) и инкубируют в течение 1 ч при
перемешивании.
2. Трижды отмывают клетки 0,1% БСА/DAB (добавив по 200 мкл в лунку),
центрифугируя панели при 500g в течение 5 мин, затем суспендируют клетки
в 25 мкл того же раствора, содержащего F (аЬ')2-фрагменты кроличьих
антител к IgG мыши, меченные 1251 [16] (2• 105 имп./мин на лунку;
специфическая активность ~4-107 имп./мин/мкг).
3. После перемешивания в течение 1 ч клетки три раза отмывают описанным
выше способом и подсчитывают связавшуюся радиоактивность. В зависимости
от используемых клеток-мишеней величина фона может варьировать от 500 до^
2000 имп./мин.
4. Можно провести анализ и в пластиковых пробирках, как детально описано
ранее [17].
Иммуноаффинная хроматография
183
Разведение антител
Рис. 5.5. Титрование антител к антигену MRC ОХ-45 в непрямой реакции
связывания. Супернатант тканевой культуры, содержащий антитела, разводили
буфером DAB с добавлением 0,02% NaN3 и 0,5% БСА. Аликвоты объемом 30 мкл
вносили в лунки панели для микротитрования, содержащие такой же объем
взвеси клеток-мишеней (2-106 тимоцитов крысы+5-106 эритроцитов барана).
Инкубация с 1251-Р(аЬ')2-фрагментами антител кролика к мышиным Ig и
процедура отмывания описаны в разд. 5.1.2
На рис. 5.5 представлены результаты титрования МКА к MRC ОХ-45 по
связыванию на тимоцитах крысы. Для реакции торможения связывания было
выбрано разведение культуральной среды гибридомы 1/150.
5.1.3. Реакция торможения связывания
Для определения содержания антигена в различных тканях можно применить
адсорбционный анализ, когда антитела пре-инкубируют с тканевым
гомогенатом, а затем после центрифугирования определяют, сколько МКА
осталось в супернатанте (рис. 5.1 и 5.2).
1. Титруют образец антител описанным выше способом, выбирают подходящее
разведение и готовят его на трис-буфере, содержащем 150 мМ NaCl и 2% БСА.
2. Готовят ряд трехкратных разведений фракций гомогена-та, содержащих
антиген в том же буфере. Если в образцах присутствуют детергенты, в буфер
добавляют 2% БСА, а при их отсутствии - 0,5% БСА (при всех реакциях
связывания, включая взаимодействие антител с клетками-мишенями, БСА
нейтрализует действие на детергент).
184
Глава 5
3. Смешивают равные объемы (например, по 100 мкл) раз-ведений антигена и
антител и инкубируют 2 ч при 4°С (время можно увеличить или сократить в
зависимости от конкретных условий и требуемой чувствительности метода).
4. Центрифугируют смеси и отбирают из каждой по две аликвоты объемом 60
мкл для определения антител по связыванию с клетками непрямым методом.
Результаты определения абсорбции антител к ОХ-45 тканевыми гомогенатами,
представленные на рис. 5.6, Л, показывают, что антигенная активность
ткани селезенки в пересчете на 1 мг белка примерно вдвое превышает
антигенную активность тимуса и в 20 раз - активность мозговой ткани. На
рис. 5.6,5 представлены результаты определения абсорбции антител
препаратом несолюбилизированных мембран крысиных спленоци-тов и
дезоксихолатным экстрактом тех же мембран. Дезоксихолат несколько смещает
кривую торможения связывания антител в сторону уменьшения антигенной
Предыдущая << 1 .. 72 73 74 75 76 77 < 78 > 79 80 81 82 83 84 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed