Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 77

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 71 72 73 74 75 76 < 77 > 78 79 80 81 82 83 .. 122 >> Следующая

элюирование дезоксихолатом, хотя последний обычно не связывается с не-
Иммуноаффинная хроматография
179-
гидрофобными участками белковых молекул [28]. Известны МКА к IX фактору
свертывания крови, распознающие детерминанту, конформация которой зависит
от присутствия ионов Са2+. Для элюирования антигена с иммуносорбента,
приготовленного из этих МКА, использовали буфер, содержащий ЭДТА [29].
Для элюирования антигенов клеточной поверхности мы в нашей практике
обычно используем 50 мМ HCl-диэтиламино-вый буфер, pH 11,5, содержащий
0,5% дезоксихолата, и сразу же после элюирования нейтрализуем элюат
глицином. Затем определяем поглощение при 280 нм и измеряем антигенную
активность препарата. Выход препарата обычно составляет около 50% от
количества антигена, нанесенного на колонку. Фракции элюата концентрируем
ультрафильтрацией и, если необходимо, освобождаем от дезоксихолата с
помощью диализа. Однажды при очистке Т-лимфоцитарного антигена,
названного MRC ОХ-34, мы не смогли определить в элюате ни антигенной
активности, ни даже поглощения при 280 нм. При этом в экстракте,
элюированном с колонки после нанесения антигена, антигенной активности
тоже не было. Мы попробовали провести элюцию 0,5 М пропионовой кислотой
без детергента и добились успеха, причем с хорошим выходом антигенной
активности (A. F. Williams, неопубликованные данные). То же самое было в
случае с крысиным антигеном CD4(W3/25). Элюирование щелочным буфером дало
неудовлетворительные результаты, но пригодным оказался 0,1 М HCl-
глициновый буфер, pH 2,5 [30]. При этом с колонки элюировался белок с
нужной мол. массой,, однако его антигенная активность частично была
потеряна. Критериями очистки в данном случае служил сам факт утраты
антигенной активности исходного экстракта после нанесения на колонку, а
также элюирование из нее белка с известной мол. массой.
В нашей практике потеря антигенной активности при элюировании встречалась
исключительно редко, зато было множество противоположных примеров, когда
после элюирования буферами с очень кислым или очень щелочным pH белки
сохраняли свою ферментативную или связывающую активность [13,. 26, 31,
32].
4.8. Емкость колонки и ее повторное использование
В нашей практике при концентрации присоединенных антител 10 мг на 1 мл
сорбента емкость колонки обычно не превышает 20% от теоретически
возможной. При такой емкости колонка объемом 10 мл способна связать 13,3
мг антигена с мол., массой 50 000. Однако чаще всего такой емкости
добиться труд-
12*
180
Глава 5
но. Особенно низка емкость колонок для крупных молекул. В некоторых
случаях она не превышает нескольких процентов от теоретически возможной.
Вероятно, большинство молекул МКА недоступно для антигена с очень большим
радиусом Стокса. Параметры, определяющие емкость колонки, так же как и
многие другие аспекты аффинной хроматографии, до сих пор еще не были
предметом систематических исследований.
Обычно аффинные колонки можно использовать повторно. Хранят их при 4°С в
буфере трис/150 мМ NaCl.
4.9. Утечка антител
В некоторых случаях мы наблюдали утечку МКА с колонки при элюировании
антигена. При этом МКА и антиген после элюирования отделялись друг от
друга с помощью гель-фильт-рации. Иногда вместо гель-фильтрации элюат
пропускали через аффинную колонку с антииммуноглобулиновыми антителами. В
последнее время мы используем антитела, присоединенные к сефарозе CL-4B,
и совсем не наблюдаем утечки антител, вероятно, благодаря применению
перекрестносшитого геля агарозы. Вообще в нашей практике утечка антител
никогда не была серьезной проблемой.
5. Очистка антигенов цитоплазматической мембраны
В этом разделе мы остановимся на процедуре очистки антигенов клеточной
поверхности (рис. 5.4). В качестве иллюстрации будет рассмотрена очистка
антигена MRC ОХ-45.
Этот антиген содержится в лейкоцитах и эндотелиальных клетках [33] и
особенно интересен тем, что на его примере проиллюстрирована процедура
выделения антигенов из двух типов тканей, а именно из селезенки и мозга.
Кроме того, пример выделения ОХ-45 из мозговой ткани крысы, где антиген
сосредоточен в основном в эндотелии капилляров, показывает, какой высокой
степени очистки можно достичь с помощью аффинной хроматографии на
моноклональных антителах.
5.1. Методы определения антигенной активности
Решающее значение имеет определение антигенной активности в экстрактах, с
помощью которого можно установить, задерживается ли антиген на колонке. В
то же время при достаточно высокой степени очистки определение антигенной
активности в элюате может служить надежным доказательством того, что
выделен нужный антиген, а не доминирующая примесь. Если в процессе
элюирования антигенная активность не-
Иммуноаффинная хроматография
181
Рис. 5.4. Этапы очистки антигенов клеточной поверхности с помощью аф
финной хроматографии при использовании иммобилизованных МКА
чезнет, нужны тщательные контроля, чтобы доказать, что преобладающий тип
Предыдущая << 1 .. 71 72 73 74 75 76 < 77 > 78 79 80 81 82 83 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed