Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 72

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 66 67 68 69 70 71 < 72 > 73 74 75 76 77 78 .. 122 >> Следующая

в надежде, что таким образом нам удастся проиллюстрировать основные
детали аффинной хроматографии при очистке других молекул. Детально мы
опишем лишь те методы, которые многократно применялись в нашей
лаборатории, а для всех прочих методов дадим (там, где это возможно)
ссылки на соответствующие источники.
2. Буферные растворы
2.1. DAB
Физиологический буфер Дюльбекко АВ фирмы Oxoid Ltd,. Великобритания.
2.2. Забуференные трисом растворы NaCl (трис/NaCl)
Расторы NaCl, концентрация которых указана в каждом случае, содержащие 25
мМ трис-HCl, pH 7,4, и 0,02% NaN3.
2.3. Трис-буферы, содержащие дезоксихолат
10 мМ трис-HCl, pH 8,2 (при комнатной температуре) или pH 8,5 при 4°С,
содержащий 0,02% NaN3 и дезоксихолат натрия в указанной концентрации.
2.4. Трис-буфер, pH 8
10 мМ трис-НС1-буфер, pH 8, содержащий 0,02% NaN3.
2.5. Буфер для элюции с высоким pH
50 мМ HCl-диэтиламиновый буфер, pH 11,5, содержащий 0,5% дезоксихолата
натрия.
3. Очистка антииммуноглобулиновых антител кролика
Как показано на рис. 5.1, очищенные антитела к Ig - это важный реагент
при серологическом использовании МКА. В настоящее время известны
коммерческие препараты таких антител, но они слишком дорого стоят для
того, чтобы их использо-
Иммуноаффинная хроматография
167
вать при очистке клеток с помощью розетирования или пэннин-га1. Для
количественного анализа, а также во избежание связывания с Fc-рецепторами
клеток, чистые антитела расщепляют до F (ab')2-фрагментов [16]. Иногда
вместо поликлональных антител в качестве вторых антител используют МКА к
Ig, однако это снижает чувствительность метода, поскольку с одной
молекулой первого антитела в этом случае связывается лишь одна молекула
второго. До сих пор не удается подобрать смесь МКА, которая бы полноценно
заменила кроличьи поликлональные анти-^-антитела. Условия эксперимента
могут иногда потребовать использования кроличьих антител, специфичных к
Fab-фрагментам, L-цепям или Fc-фрагментам первых антител. Кроме того,
всегда существует проблема перекрестных реакций антиглобулиновых антител
с собственными Ig, фиксированными в исследуемой ткани. Так бывает, в
частности, когда МКА мыши используются для изучения крысиных тканей, или
наоборот, поскольку кроличьи антитела к Ig, например, мыши дают
значительную перекрестную реакцию с Ig крысы. Кроличьи антитела к Ig
грызунов практически не дают перекрестных реакций с Ig других видов
животных. В любом случае молекулы антител, обладающие перекрестной
активностью, легко удалить на соответствующей аффинной колонке или
заблокировать, добавив в среду IgG или сыворотку. Ниже приведена схема
получения кроличьих антител к IgG мыши, которые не дают перекрестных
реакций с IgG крысы.
3.1. Выделение мышиного или крысиного IgG
См. гл. 2. Мы используем этот метод для выделения IgG как мыши, так и
крысы, стараясь фракционировать одновременно по возможности больший объем
сыворотки. Краткая схема выделения приведена ниже:
1. 100 мл мышиной или крысиной сыворотки центрифугируют (более 10 ООО g)
в течение 30 мин, отделяют супернатант, добавляют к нему Na2S04 до
концентрации 18% (вес на объем) и затем инкубируют 30 мин при 37 °С.
2. Центрифугируют при 5000 g в течение 15 мин при 25 °С и собирают
осадок.
1 Пэннинг-метод очистки клеток с помощью антител, иммобилизованных на
пластике. Антитела иммобилизуют на пластиковой чашке Петри, затем
наливают в нее суспензию клеток. После того как часть клеток свяжется с
антителами, суспензию сливают. Процедуру можно повторить несколько раз. В
зависимости от задачи эксперимента очищаемая фракция будет содержаться в
суспензии или на чашках. С чашек клетки удаляют интенсивным
перемешиванием.- Прим. перев.
Для определения антигена по подавлению связывания МКА его инкубируют со
специфическими МКА, затем измеряют количество несвяэавшихся антител
X + моноклональные антитела анти- X
или
растворимый антиген X, адсорбированный в лунках панели для
микротитрования
Антиген X, адсорбированный на нитроцеллюлозе
Инкубация сантителами к Ig
Отмывание
X анти-Х
Конъюгированными с флуоресцеином
КинъЮгированными Меченными с коллоидным золотом 1251
Конъюгированными с пероксидазой
Конъюгированными с эритроцитами
Иммобилизованными в лунках панели
I I I I I I
Электронная Цитофлуориметрия Розетирование Пэинингдля
"У-ГЧРТЧИК ФРПМРиг
микроскопия ^ (FACS) для удаления накопления
клеток клеток
Рис. 5.1. Использование очищенных антител к ig в различных вариантах
непрямой реакции связывания с МКА
Иммуноаффинная хроматография
169
3. Суспендируют осадок в 33 мл воды, добавляют Na2S04 до концентрации 16%
и вновь собирают осадок центрифугированием.
4. Суспендируют осадок в 25 мл воды и диализуют трижды против 1 л буфера
трис/50 мМ NaCl при 4°С.
5. pH и кондуктометрические характеристики диализованного IgG должны
совпадать с соответствующими параметрами буфера, используемого при
диализе.
6. Центрифугируют для удаления нерастворимого материала и определяют
Предыдущая << 1 .. 66 67 68 69 70 71 < 72 > 73 74 75 76 77 78 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed