Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 73

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 67 68 69 70 71 72 < 73 > 74 75 76 77 78 79 .. 122 >> Следующая

оптическую плотность при длине волны 280 и 260 нм в кювете с длиной
оптического пути 1 см. Отношение поглощения при 280 нм к поглощению при
260 нм примерно должно составлять 1,6; определяют концентрацию белка в
мг/мл, разделив величину поглощения при 280 нм на 1,4. Из 100 мл мышиной
сыворотки можно выделить до 360 мг белка
(IgG).
7. Наносят материал на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой объемом 50 мл (например,
Whatman DE-52) в том же буфере и собирают несвязавшуюся фракцию. Она
должна содержать около 180 мг белка, представляющего собой в основном
IgG. Препарат можно подвергнуть дальнейшей очистке с помощью гель-
фильтрации на колонке с сефакрилом S300 в буфере трис/150 мМ NaCl.
Чистоту препарата проверяют с помощью электрофореза в полиакриламидном
геле в присутствии ДСН в восстанавливающих и невосстанавливающих
условиях. Препарат мышиных IgG содержит IgG 1, IgG2a и IgG2b, а крысиных
в основном-¦ IgG2a, IgG2b и IgG2c. В каждом случае именно к этим
подклассам обычно принадлежат МКА.
3.2. Иммунизация
Для иммунизации используют наиболее чистые препараты IgG.
1. Вводят четырем кроликам внутримышечно по 0,5-1 мг мышиных IgG в полном
адъюванте Фрейнда (см. гл. 2) в левое, а затем через неделю в правое
бедро.
2. Через месяц после первой инъекции берут кровь и определяют в сыворотке
содержание антител методом двойной иммунодиффузии в агаровом геле (см.
гл. 6) либо непрямым методом по связыванию на пластиковых панелях для
микротитрования, нагруженных мышиным IgG.
3. При низком содержании антител кроликов повторно иммунизируют, вводя
каждому внутрибрюшинно по 0,5-1,0 мг
170
Глава 5
адсорбированного на квасцах IgG (см. гл. 2). Повторную иммунизацию можно
сделать и подкожно в неполном адъюванте Фрейнда или внутривенно без
адъюванта. Антисыворотка должна содержать около 2 мг/мл антител к IgG.
4. Собирают достаточно большой объем сыворотки (например, 500 мл),
инкубируют ее при 56°С в течение 30 мин, а затем перед аффинной
хроматографией центрифугируют при 40 000 g в течение 30 мин.
3.3. Очистка антител [16]
Все этапы выполняют при 4°С.
1. Мышиный или крысиный IgG присоединяют к гранулам сефарозы CL-4B (см.
ниже). Конечная концентрация иммобилизованного белка должна составлять
около 10 мг/мл геля. Приготовляют колонки объемом по крайней мере 20 мл
(мы обычно .работаем с колонками объемом 40 мл). Каждую колонку промывают
150 мл 1М пропионовой кислоты, а затем буфером трис/500 мМ NaCl.
2. Антисыворотку к IgG мыши наносят на колонку с крысиным IgG, подавая
примерно 1 объем колонки в час, и проверяют полноту истощения вышедших из
колонки фракций от перекрестно реагирующих антител. Затем все эти фракции
объединяют и наносят на колонку с IgG мыши. Определяют содержание антител
к Ig мыши в вышедших из колонки фракциях до полного насыщения колонки.
Далее обе колонки промывают буфером трис/500 мМ NaCl до тех пор, пока
оптическая плотность элюата при 280 нм (1 см) не станет меньше 0,05.
3. Проводят элюцию 1М пропионовой кислотой. По мере элюирования
определяют оптическую плотность фракции: во фракциях с наибольшим
содержанием антител может появиться помутнение. Препарат следует
немедленно нейтрализовать сухим трисом. После элюции вновь уравновешивают
колонку буфером трис/150 мМ NaCl. Если не предполагается получать из
антител Е(аЪ')2-фрагменты, то элюат просто диализуют против буфера
трис/150 мМ NaCl или другого, выбранного буфера. Количество чистого IgG,
элюируемого с колонки, насыщенной антителами, приблизительно равно
количеству иммобилизованного IgG.
4. Для получения F(ab')2-фрагментов элюат диализуют против 0,1 М Na-
ацетатного буфера, pH 4,4 и добавляют до 2% (по Весу) пепсин.
Концентрация антител должна превышать 10 мг/мл. Если она недостаточна,
препарат концентрируют ультрафильтрацией. Инкубируют 6-8 ч при 37 °С,
затем добавляют еще 1% (по весу) пепсина и инкубируют смесь в течение 12
ч.; (Мбжно и более точно определить продолжительность
Иммуноаффинная хроматография
171
ферментативного гидролиза, сравнивая между собой электро-фореграммы проб,
взятых в разное время из гидролизуемой смеси и исследованных методом
электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН до и после
восстановления.) После окончания инкубации значение pH доводят трисом до
7 и отделяют F(ab/)2 от других фрагментов с помощью гель-фильтрации на
Сефакриле S200 (Pharmacia, Швеция) в буфере трис/150 мМ NaCl. Гель-
фильтрация контролируется по оптической плотности элюата при 280 нм и с
помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии DCH. Обычный
выход F (ah')г'фрагментов около 50% от веса ферментируемого IgG, что
составляет 75% теоретически возможного выхода.
5. Препарат концентрируют ультрафильтрацией до нужной степени и хранят
при -20°С.
4. Аффинная хроматография с использованием моноклональных антител
4.1. Антитела для приготовления иммуносорбента
При использовании аффинной хроматографии для выделения антигена из
раствора используют антитела, иммобилизованные на нерастворимом носителе.
Предыдущая << 1 .. 67 68 69 70 71 72 < 73 > 74 75 76 77 78 79 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed