Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка):
готовы выслать нужные линии в ответ на письменный запрос. Выбор того или
иного партнера для гибридизации определяется исключительно волей
экспериментатора, однако наиболее успешные, на наш взгляд, результаты
дает использование мышиных плазмацитом, а также гетеромиелом.
3. Получение моноклональных антител человека путем ВЭБ-трансформации
В-лимфоцитов
3.1. Введение
Конкретный план экспериментов, включая выбор донора, получение и очистку
клеток-предшественников, а также методы выявления МКА, определяется
природой выбранного антигена. Прежде чем начать работу, которая может
оказаться весьма трудоемкой, экспериментатор должен быть уверен, во-
первых, в реальной возможности получения достаточного количества
158
Глава 4
клеток-предшественников и, во-вторых, в существовании простого метода
быстрого выявления антител нужной специфичности, дающего однозначные
результаты. Для простоты мы изложим современный подход к получению МКА
человека на примере антител к резус D (RhD)-антигену. Отклонения от
стандартной схемы, необходимые при работе с другими антигенными
системами, будут обсуждаться ниже. Мы выбрали в качестве модели именно
антиген RhD, потому что эта наиболее подробно изученная на сегодня
система позволяет делать необходимые сравнения и предлагать оптимальные
подходы.
Основная программа эксперимента - накопление, размножение и клонирование
клеток, продуцирующих нужные антитела, и в конечном счете получение
стабильных клонов путем гибридизации.
3.2. Подготовка клеток к заражению ВЭБ
Взвесь МКПК, приготовленных по методу, описанному в разд. 2.2, состоит из
моноцитов, Т- и В-лимфоцитов. В-лимфо-циты составляют 5-10% от общего
числа клеток, и в лучшем случае лишь 1% всех В-лимфоцитов синтезирует
антитела нужной специфичности. Если на этой стадии сконцентрировать
интересующие нас клетки, это существенно уменьшит объем дальнейшей
работы. Можно выбрать один из трех способов накопления нужных клеток:
1. Можно заразить МКПК вирусом и культивировать без разделения. В такие
неразделенные культуры необходимо добавлять фитогемагглютинин, иначе
появившиеся специфические цитотоксические Т-лимфоциты вызовут гибель,
ВЭБ-трас-¦ формированных В-лимфоцитов [9]. Если же непосредственно
после заражения провести клонирование инфицированных клеток, то
добавление фитогемагглютинина необязательно, поскольку популяция
цитотоксичес'ких Т-клеток будет сильно разбавлена.
2. Перед заражением из взвеси МКПК можно удалить Т-лимфоциты путем
розетирования с отмытыми эритроцитами барана. Для этого взвесь МКПК в
концентрации 2-106 клеток/мл в среде RPMI-1640, содержащей 10% СПК,
смешивают с равным объемом 2%-ной взвеси отмытых эритроцитов барана в
PBS. После 5-мин инкубации при 37 °С клетки осаждают, осторожно
центрифугируя при 150g в течение 3 мин, и после этого инкубируют на льду
1 ч. Затем клеточный осадок ресус-пендируют, слегка встряхивая пробирку.
Далее клетки наслаивают на равный объем смеси фикол-пак и центрифугируют
:20 мин при 400g, после чего собирают фракцию клеток, расположенных на
границе раздела фаз и трижды отмывают в
Моноклональные антитела человека
159
RPMI-1640. Выделенные клетки представляют собой моноциты и В-лимфоциты.
3. Можно непосредственно сконцентрировать и В-лимфоци-ты,
синтезирующие антитела нужной специфичности. Это осуществляют вслед за
только что описанной процедурой удаления Т-лимфоцитов (или без нее). В
целом особенности выделения В-лимфоцитов зависят от конкретного антигена;
в некоторых случаях сконцентрировать В-клетки вообще невозможно и
приходится использовать варианты 1 или 2. Однако для селективного
выделения В-клеток, образующих антитела к RhD-антиге-ну, очень удобно
использовать простую реакцию розетирования. Методика очень похожа на
удаление Т-клеток (вариант 2), за исключением того, что лимфоциты
образуют розетки с отмытыми эритроцитами RhD-положительного донора
(группа крови 0), и последующая инкубация при 37 °С не обязательна. Кроме
того, собирают клетки, прошедшие сквозь градиент, а не расположенные на
границе раздела фаз. Собранные клетки затем заражают ВЭБ.
3.3. Заражение клеток вирусом Эпштейна - Барр
1. Клетки, полученные согласно описанной выше методике (варианты 1-3),
осаждают центрифугированием и ресуспендируют в среде, содержащей вирус,
до конечной концентрации
2-106 клеток/мл.
2. Инкубируют клетки с вирусом 1,5 ч на водяной бане при 37°С,
перемешивая взвесь каждые 15 мин.
3. Клетки однократно отмывают и суспендируют в полной среде (RPMI-
1640+10% СПК, антибиотики и фунгициды) для культивирования. Если
приготовлена обогащенная фракция В-клеток, рекомендуется добавить в среду
2-меркаптоэтанол до конечной концентрации 5-10-5 М.
3.4. Размножение ВЭБ-трансформированных В-клеток
После заражения ВЭБ можно увеличить количество клеток, размножая их in
vitro. Взвесь, содержащую 2-106 зараженных клеток в 1 мл полной среды,
помещают в культуральную посуду подходящего размера. Лучше использовать