Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 69

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 63 64 65 66 67 68 < 69 > 70 71 72 73 74 75 .. 122 >> Следующая

флаконы для культивирования с плоским дном, поскольку в них рост клеток
легко оценить на глаз. Если из исходной взвеси не были удалены Т-клетки,
то в течение первой недели культивирования в среду необходимо добавлять
фитогемагглютинин (например, Gibco, 1 : 100). Через четыре дня
культивирования можно увидеть, что некоторые клетки образуют агломераты,
в то время как другие явно погибают. Размножающиеся клетки - это не что
иное, как успешно трансформированные В-лимфоциты.
160
Глава 4
Через одну-две недели уже можно проверить, содержатся ли в культуральной
среде искомые антитела. Если результат отрицательный, продолжать
культивирование, разумеется, бессмысленно. Если же антитела обнаружены,
предстоит выбрать един из двух вариантов для продолжения работы.
3.5. Селекция клеток, образующих антитела нужной специфичности, с
помощью соответствующего антигена.
Получение моноклональной культуры
Исследователи, впервые пытавшиеся получить моноклональные антитела путем
ВЭБ-трансформации В-лимфоцитов, наблюдали быстрое прекращение продукции
антител при культивировании необогащенной взвеси клеток. Клетки,
образующие антитела нужной специфичности, вытеснялись клетками,
синтезирующими иммуноглобулины посторонней специфичности. Чтобы решить
эту проблему, были предприняты попытки повысить в культуре концентрацию
клеток, синтезирующих нужные антитела [10]. Теоретически это должно в
конце концов привести к появлению моноспецифичной линии или по крайней
мере к значительному росту числа клеток, образующих нужные антитела.
Имеются сообщения о том, что с помощью этого подхода можно добиться
успеха.
Для отбора В-клеток, образующих антитела к антигену RhD, можно
воспользоваться описанной выше методикой розе-тирования с эритроцитами.
Для других антигенов могут потребоваться иные методы обогащения культуры,
которые мы обсудим ниже. С помощью таких приемов можно наращивать синтез
антител до тех пор, пока культура не станет моноклональной или по крайней
мере моноспецифичной.
3.6. Клонирование линий клеток, образующих антитела
В качестве альтернативы описанному выше подходу или дополнения к нему,
для размножения клеток, образующих антитела, и доведения культуры до
состояния моноклональности можно использовать простые методы
клонирования. Одни исследователи проводят клонирование на как можно более
ранних стадиях культивирования, т. е. непосредственно после заражения
клеток ВЭБ [И]. Другие дают ВЭБ-зараженным клеткам подрасти и затем
клонируют их [12]. Преимущество клонирования заключается в том, что
культивируемая линия клеток, образующих антитела, с самого начала
становится моноклональной. Непреодолимый недостаток клонирования,
особенно в тех случаях, когда не применяется обогащение кле-
Моноклональные антитела человека
161
Таблица 4.1. Методика получения моноклональных антител в неразделенных
культурах МКПК человека
1. Выращивают ВЭБ-трансформнрованные клетки в течение 2-3 нед.
2. Выявляют синтезированные антитела.
3. Рассевают взвесь клеток (по 104) в лунки двух панелей для микро-
тнтровання (площадь дна лунки = 0.32 см2).
4. Выращивают клетки в течение 3-5 дней.
5. Выявляют продукцию антител.
6. Засевают от 10 До 1000 клеток, синтезирующих антитела, в лунки,
содержащие фидерный слой.
7. Культивируют клетки еще 3-5 дней (а возможно, и дольше для того, чтобы
наблюдать рост в лунках, засеянных малым числом клеток), а затем выявляют
продукцию антител.
8. На данном этапе можно с помощью изоэлектрофокусирования (ИЗЭФ) оценить
моноклональность образующихся антител, и, если требуется, культуру
реклонируют.
ток, образующих антитела, состоит в том, что число лунок, которое
требуется анализировать на каждом этапе, может быть чрезмерно большим.
Ясно, что требуется найти компромисс. В табл. 4.1 приведена методика
получения МКА в культурах неразделенных МКПК, в которой найдено
равновесие между стремлением добиться моноклональности клеток, образующих
антитела, и желанием ограничить число анализируемых микрокультур. Эта
методика дает наилучшие результаты, если до заражения ВЭБ проводят и
обогащение культуры клетками-продуцентами. Если же это невозможно,
рекомендуется начать с удаления из взвеси МКПК Т-клеток (см. выше).
3.7. Стабилизация клеточных клонов, образующих антитела
В некоторых случаях клоны трансформированных ВЭБ клеток становятся
истинно бессмертными линиями. Однако, как показывает опыт многих
исследователей, большая часть ВЭБ-трансформированных клонов утрачивает
способность к росту или образованию антител [12]. Кроме того, даже если
клон остается стабильным, его уровень продукции антител может быть весьма
низким. Именно поэтому в настоящее время все больше внимания уделяется
попыткам гибридизации ВЭБ-трансформированных клеток со стабильными
клеточными линиями, чтобы получить стабильные клоны, активно
синтезирующие антитела.
Принципы гибридизации те же, что были описаны в гл. 2 для получения
моноклональных антител грызунов. Возможные кандидаты в партнеры для
Предыдущая << 1 .. 63 64 65 66 67 68 < 69 > 70 71 72 73 74 75 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed