Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 67

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 61 62 63 64 65 66 < 67 > 68 69 70 71 72 73 .. 122 >> Следующая

клеток мармозетки В95-8. Эта линия имеется во многих институтах, однако в
случае затруднений автор настоящей главы готов ее предоставить. Весьма
желательно, чтобы линия, используемая для репликации вируса, была
свободна от микоплазм. В присутствии микоплазм эффективность клонирования
В-лимфоцитов, инфицированных ВЭБ, резко падает, так же как и способность
к стабильному росту. Проверять линию на контаминацию микоплазмами следует
не только при поступлении ее в лабораторию, но и регулярно во время всех
пересевов.
Незараженная микоплазмами линия В95-8 растет в виде .монослоя,
обладающего слабой адгезивностью к подложке. Для культивирования
используют среду RPMI-1640, содержащую •8% сыворотки плода коровы (СПК) и
стандартную добавку L-глутамина, антибиотиков и, если необходимо,
фунгицидов. Как правило, линию выращивают в стандартных флаконах для
культивирования, поместив их горизонтально в термостат во влажную
атмосферу, содержащую 5% СОг. Для рассева культуры нужно плотно завернуть
крышку и, встряхивая флакон, добиться отделения части клеток от пластика,
затем перенести их в новый флакон. При нормальной скорости роста это надо
делать 1-2 раза в неделю.
156
Глава 4
Линия В95-8 спонтанно выделяет в среду вирус Эпштейна - Барр. Для
получения достаточного количества вируса, вначале выращивают клетки до
состояния сплошного монослоя, затем плотно закручивают крышку флакона и
оставляют его в термостате на 10-14 дней. По истечении этого времени
культуральная жидкость пожелтеет. Ее сливают из флакона и в асептических
условиях фильтруют через мембрану с диаметром пор 0,45 мкм, чтобы
освободить от клеток и дебриса. Применение мембран с более мелкими порами
нецелесообразно из-за неизбежных потерь вируса. Если вирус не будет
использован в тот же день, фильтрат разливают на небольшие порции, каждая
из которых достаточна для заражения примерно 5-106 клеток, и хранят при -
70 °С. Обычно такая порция имеет объем около 2 мл. Имеет смысл заготовить
большую партию содержащего вирус фильтрата, инфекционность которого
установлена при титровании одной порции. Лучший и наиболее быстрый способ
оценки активности вируса-это определение его титра по стимуляции синтеза
ДНК в В-лимфоцитах. Синтез ДНК определяют по включению [3Н]-тимидина на
3-й день после заражения. Описание этого простого метода читатель найдет
в литературе [4]. При необходимости можно осадить вирус из отработанной
среды центрифугированием и, суспендировав его в меньшем объеме свежей
среды, хранить, разлив на небольшие порции, при -70 °С. Эта процедура
имеет двойное преимущество, поскольку, во-первых, вирус будет
сконцентрирован, а во-вторых, удален из кислой среды, которая может
повредить инфицируемые клетки.
2.2. Фидерные клетки
В качестве лучшего фидерного слоя для клонирования ВЭБ-трансформированных
клеток предлагались самые разные типы клеток. Чаще других применяют
мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и фибробласты, в
частности легочные фибробласты плода человека. Проще всего получить МКПК,
выделение которых описано ниже. Известны различные источники МКПК. Можно,
например, использовать клетки, которые остаются после выделения
лимфоцитов, связавшихся с исследуемым антигеном (см. разд. 3.2). Другой
вариант - использовать кровь любого здорового донора. Целесообразно
испытать в качестве фидерного слоя клетки от нескольких доноров и выбрать
лучшие. Вне зависимости от особенностей донорской крови процедура
выделения МКПК относительно проста.
1. Кровь, разведенную PBS в соотношении 1 :2, наслаивают на равный
объем градиента плотности типа фиколл-пак (Pharmacia, Швеция).
Моноклональные антитела человека
157
2. После центрифугирования градиента с нанесенной кровью в течение 20 мин
при 400 g собирают пипеткой слой клеток на границе раздела фаз, трижды
отмывают средой RPMI-1640 и суспендируют в полной среде до конечной
концентрации 2-106 клеток/мл.
3. По 100 мкл клеточной взвеси вносят в лунки 96-луночной панели для
культивирования.
4. Подвергают клетки "f-облучению в дозе 4000 рад примерно за 1-2 ч до
рассева ВЭБ-трансформированных лимфоцитов.
2.3. Партнеры для гибридизации
В настоящее время для соматической гибридизации В-кле-ток человека можно
воспользоваться одним из четырех партнеров:
1. Линии миеломных клеток человека [5].
2. Линии ВЭБ-трансформированных лимфобластоидных клеток человека [6].
3. Линии мышиных плазмацитом [7].
4. Гетеромиеломы [8].
Используемая линия должна быть дефектна по гену гипок-сантин-гуанин-
фосфорибозилтрансферазы, а в идеальном случае обладать и маркером
резистентности, например к уабаину, к которому чувствителен второй
партнер по гибридизации. Это необходимо в связи с тем, что в отличие от
В-клеток грызунов используемые В-клетки человека сами могут быть
иммортали-зованы в результате ВЭБ-трансформации. Более подробную
информацию о партнерах для гибридизации читатель найдет в литературе,
указанной в конце настоящей главы. Практически все упомянутые авторы
Предыдущая << 1 .. 61 62 63 64 65 66 < 67 > 68 69 70 71 72 73 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed