Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 80

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 74 75 76 77 78 79 < 80 > 81 82 83 84 85 86 .. 122 >> Следующая

в которой количество клеточных ядер на единицу веса гораздо меньше, можно
сразу проводить экстракцию дезоксихолатом, поскольку в этом случае
вязкость экстракта, очевидно, не будет чрезмерной.
Для дезоксихолатной солюбилизации необходимо прежде всего приобрести
партию реагента с низким значением поглощения при 280 нм (<0,025 для
0,05%-ного раствора). Такой дезоксихолат можно без предварительной
обработки использовать почти на всех этапах очистки, однако реагент,
применяющийся на последней стадии очистки антигена, должен быть свободен
от неудаляемых диализом примесей. Для приготовления такого реагента 250
мл 10%-ного дезоксихолата помещают в диализный мешок и диализуют против 5
л буфера. Мы обычно используем 10 мМ трис-НС1-буфер, pH 8,2 (при
комнатной температуре), содержащий 0,02% ЫаЫз, и получаем после диализа 5
л 0,5%-ного раствора дезоксихолата в этом буфере.
188
Глава 5
III. Неионные детергенты. Они используются для прямой солюбилизации
мембранных молекул из целых клеток. Эти детергенты также обладают
некоторыми недостатками: они солюбилизируют не все мембранные молекулы,
большие размеры мицелл снижают эффект гель-фильтрации и, наконец,
неионные детергенты невозможно удалить диализом.
5.2.3. Ингибиторы протеиназ
Солюбилизацию клеток или мембран детергентами мы всегда проводим в
присутствии ингибиторов протеиназ, а иногда используем их и в процессе
выделения мембран. Для ингибирования протеиназ, расщепляющих дисульфидные
связи, мы используем иодоацетамид в конечной концентрации 2,5 мМ. Кроме
того, этот ингибитор блокирует свободные сульфгидриль-ные группы и таким
образом предотвращает образование ди-сульфидных связей между молекулами.
Для инактивации се-риновых протеиназ, с которыми в основном связывают
общую протеолитическую активность лимфоцитов [39], мы применяем
фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) (раньше мы использовали
диизопропилфторид, но с ним сложнее работать, а ФМСФ, по-видимому, ничуть
не менее эффективен). ФМСФ ядовит, поэтому хранить его следует в
небольшом эксикаторе в вытяжном шкафу и работать с ним только под тягой.
Перед использованием ФМСФ сначала взвешивают небольшой стеклянный бюкс с
крышкой, затем в вытяжном шкафу помещают в него ингибитор и, закрыв
крышкой, вновь производят взвешивание. ФМСФ растворяют в изопропаноле до
концентрации 100 мМ. Вначале ФМСФ добавляют к препарату до конечной
концентрации 0,5 мМ, а затем на решающих этапах очистки вводят
дополнительные аликвоты ингибитора до концентрации 0,1 мМ. Это необходимо
потому, что ФМСФ легко гидролизуется в воде, а предшественники ферментов
могут активироваться на любой стадии приготовления препарата. Мы не
храним остаток раствора ФМСФ в изопропаноле, а разбавив его водой в
вытяжном шкафу, сливаем в канализацию с большим объемом воды.
5.2.4. Приготовление препарата неочищенных мембран
Самым простым способом приготовления препарата мембран мы считаем
описанный ниже метод с использованием твина-40. Все процедуры проводят
при 0-4°С.
1. Если необходимо выделить мембраны из клеток, легко отделяющихся от
стромы и переходящих в суспензию (например, из тимоцитов), ткань тимуса
измельчают в буфере трис/140 мМ NaCl, pH 7,4, и фильтруют через кисею.
Концент-
Иммуноаффинная хроматография
18?
рацию клеток в полученной взвеси доводят до 109 в 1 мл. Чтобы сохранить
фрагменты разрушенных клеток, клеточную взвесь не следует отмывать. Для
последующей обработки удобно приготовить 250 мл клеточной взвеси. Если
требуется выделить мембраны непосредственно из плотной ткани, например из
селезенки, берут 125 г ее (или другой исследуемой ткани) и гомогенизируют
в 250 мл буфера трис/140 мМ NaCl, pH 7,4, в гомогенизаторе Уоринга.
2. Готовят 5%-ный раствор твина-40 в буфере трис/140 мМ. NaCl, pH 7,4
(для растворения твина-40 смесь надо подогреть, а после растворения вновь
охладить). Добавляют равный объем раствора твина-40 к взвеси или
гомогенату клеток. На этом этапе можно ввести ингибиторы протеиназ,
например, 2,5 мМ июдоацетамида и 0,5 мМ ФМСФ.
3. Перемешивают клетки с детергентом в течение 60 мин, а затем
гомогенизируют шестью ударами поршня в электрическом гомогенизаторе
Поттера - Элвейджема объемом 100 мл. Центрифугируют гомогенат при 1500g в
течение 10 мин и собирают супернатант, в котором должно содержаться
примерно 60% исходной антигенной активности. Осадок суспендируют в 2,5%-
ном растворе твин-40 (готовят на том же буфере). Объем смеси на этот раз
должен составлять Vs объема, полученного в п. 2. Смесь снова
гомогенизируют и центрифугируют. Полученный супернатант должен содержать
еще 20% от исходной антигенной активности.
4. Супернатанты объединяют и подвергают центрифугированию. При простом
центрифугировании получают осадок неочищенных мембран, при
центрифугировании через "сахарозную подушку" - частично очищенные
мембраны. В последнем случае супернатант наслаивают на 32%-ный раствор
сахарозы в трис-буфере, pH 8, и используют центрифугу фирмы Beckman с
Предыдущая << 1 .. 74 75 76 77 78 79 < 80 > 81 82 83 84 85 86 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed