Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 82

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 76 77 78 79 80 81 < 82 > 83 84 85 86 87 88 .. 122 >> Следующая

сорбента. Перед очисткой сорбент элюируют буфером с высоким значением pH.
Колоночный и бесколоночный методы очистки дают хорошие результаты,
позволяя практически полностью выделить анти-
192
Глава 5
Таблица 5.2. Очистка антигена MRC ОХ-45 из эндотелия селезенки и мозга
Фракции Количество белка (МГ)1' Антигенная активность (ед.-10-V)
Выаод апти-генной активности (%) Относ, спецнфич. активность
Селезенка
Экстракт, приготовленный с помощью твииа из 520 г ткани селезенки 52
000 1937 100 1
Неочищенные мембраны 7700 1395 72 4,9
Дезоксихолатный экстракт 7000 620 32 2,2
После нанесения на колонку иммобилизованных антител к MRC ОХ-45 7 540
31 1,6
Элюат с колонки - 434 22 -
После хроматографии на се-факриле S300 - 291 15 -
После удаления дезоксихолата Мозг 1,06 437 22,6 11 000
Дезоксихолатный экстракт из 340 г мозговой ткани 17 000 41,2 100
1
После нанесения на колонку иммобилизованных антител к MRC ОХ-45 16
200 -0 ~0
Элюат с колонки - 25,6 62 -
После хроматографии на сефа-криле S300 - 18,7 45 -
После удаления дезоксихолата 0,114 32,5 79 11 ссо (17 0 0000
*) Концентрацию белка в экстрактах измеряли по Лоури, а концентрацию
чистого гликопротеина - по данным аминокислотного анализа.
*) Одна единица активности антигена MRC ОХ-45 - это такое его количество,
которое требуется для 50%-ного подавления связывания МКА.
3) По данным количественной иммуносорбцни итоговый коэффициент очистки
антигена MRC ОХ-45 относительно исходного гомогената мозга достигает 170
000.
ген примерно из одного литра экстракта с одинаково высокой
степенью чистоты (табл. 5.2).
3. Вначале колонки промывают трис-буфером, содержащим 0,5% дезоксихолата,
затем 0,15 М раствором NaCl в том же буфере (см. разд. 4.6) и, наконец,
трис-буфером, содержащим 0,5% дезоксихолата натрия до тех пор, пока
значение поглощения элюата при 280 нм не вернется к исходному.
4. Элюирование связавшегося материала производят 0,05 М HCl-
диэтиламиновым буфером, pH 11,5, содержащим 0,5% дезоксихолата и 0,02%
NaN3. Определив поглощение фракций при 280 нм, доводят их pH до 8-9 сухим
глицином. На рис. 5.7 показан типичный профиль элюции. Антиген начинает
выходить из колонки несколько раньше, чем повышается pH, вероятно,
потому, что колонка обладает некоторой буферной емкостью.
Иммуноаффинная хроматография
193
0,3 - pH 8,3 8,5 11,5
>
*
о
О _____________________________________ I__________________L.
2 4 6
8
10
Номер фракции
Рис. 5.7. Профиль элюции селезеночного антигена ОХ-45 с колонки с
иммобилизованными антителами. Элюцню проводили 0,05 М НС1-диэтнлами-новым
буфером, pH 11,5, содержащим 0,5% дезоксихолата натрия и 0,02% NaN3.
Собирали фракции по 4 мл н определяли в ннх pH, поглощение при 280 нм
(черные квадраты) и антигенную активность (черные треугольники)
5. Элюат концентрируют, диализуют и анализируют с помощью электрофореза в
полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Следы антител в элюате
выявляются на электрофоре-грамме только при первом использовании колонки.
6. На заключительной стадии очистки проводят гель-фильтрацию на колонке с
сефакрилом S300. Антигенная активность выходит из колонки в виде
симметричного пика, совпадающего с главным пиком белка (рис. 5.8).
7. Наиболее чистые (по данным электрофореза) фракции, содержащие
антигенную активность, объединяют, концентрируют и диализуют против 0,1 М
NH4HCO3, чтобы удалить дезоксихолат до биохимического анализа. При
электрофорезе чистый антиген мигрирует в виде слегка размытой полосы
(рис. 5.9), что, по-видимому, вызвано высоким содержанием углеводов.
В качестве исходного материала был взят дезоксихолатный экстракт из 340 г
крысиного мозга, приготовленный, как описано в разд. 5.2.7. Вначале из
экстракта выделяли антиген ОХ-2 [42], после чего заморозили при -40 °С.
После оттаива-
5.2.9. Выделение антигена OX-4S из мозговой ткани
13-997
194
Глава 5
s
" 0.1
I
?
>
с
Ё 0,08
о

X
?
с;
=t
's °'06
?
с 0,04 0>
?
X
3
о
| 0,02 с:
0
20 30 40 50 . 60 70
Номер фракции
Рис. 5.8. Гель-фильтрация антигена ОХ-45 из селезенки. Элюат с аффинной
колонки подвергли хроматографии на сефакриле S300 (использовали колонку
2,2X75 см) в 0,01 М трис-HCl буфере, pH 8, содержащем 5%. дезоксихолата
натрия, 0,02% NaN3. Собирали фракции по 4,5 мл и опрет деляли в' них
антигенную активность (светлые кружки) и концентрации? белка (по
поглощению при 280 нм, черные кружки). Предварительно провели калибровку
колонки. Vo - свободный объем, БГГ - бычий угл°бу-лин, ОБА - овальбумин,
МГ - миоглобин
ния к эстракту добавили ингибиторы протеиназ и центрифугировали при 70
000 g в течение 60 мин.
Выход препарата и степень очистки приведены в табл. 5.2.
Электрофореграмма очищенного антигена показана на рис. 5.9. Легко
заметить, что антиген, выделенный из мозга, выглядит точно так же, как и
антиген из селезенки. Небольшие различия по мол. массе обусловлены разным
углеводным составом [33]. По сравнению с дезоксихолатным экстрактом
Предыдущая << 1 .. 76 77 78 79 80 81 < 82 > 83 84 85 86 87 88 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed