Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 84

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 78 79 80 81 82 83 < 84 > 85 86 87 88 89 90 .. 122 >> Следующая

реплик, полученных методом Вестерн-блоттинга после электрофореза в
полиакриламидном геле.
Явление 'иммунопреципитации в гелях широко используется в целом ряде
важных методик, .которые широко применяются для изучения антител, а также
для обнаружения и количественного определения растворимых антигенов.
Иммуно-преципитация основана па очень простом принципе. В толще гелей
существует водная фаза, через которую легко диффундирует большинство
макромолекул (мол. масса может превышать 106). Когда полидетерминантный
сложный антиген перемещается в зону, содержащую антитела, то при
оптимальном соотношении концентраций взаимодействующих компонентов
образуются видимые линии преципитации. Реакцию обычно проводят в
.расположенных горизонтально тонких пластинах агарового геля на
стеклянных подложках. Для реакций простой и двойной диффузии антигены и
антитела вносят в лунки, вырезанные в геле напротив друг друга [1, 2].
Известны различные модификации метода иммунодиффузии: а) иммуноэлектро-
форез (комбинация электрофоретического разделения белков по заряду с
двойной диффузией и иммунопреципитацией в геле [3]; б) ракетный и
двумерный электрофорез (электрофоретическое разделение антигенов в геле
агарозы, содержащем антитела, см. работы [4-6]), что ускоряет
преципитацию, облегчает (идентификацию антигенов и позволяет производить
их количественное определение; в) иммунодиффузия антигена в агаровом
геле, содержащем антитела (или наоборот), что приводит к образованию
колец преципитации, диаметр которых пропорционален концентрации антигена
(антител) [7,8]. Мы подробно опишем все перечисленные методы, рассмотрим
некоторые примеры их применения, а также ,их сравнительные достоинства и
недостатки. В последнем разделе настоящей главы приведена технология
иммунохимического окрашивания реплик, полученных с помощью Вестерн-
блоттинга [9, 10] по-
198
Глава 6
еле разделения антигенов методом электрофореза в полиакриламидном геле.
Эта технология очень важна для определения молекулярных размеров
антигена, а также гетерогенности антигенов и антител.
2. Оборудование и материалы для методов преципитации в геле
2.1. Основное оборудование
(список фирм, поставляющих оборудование и материалы, см. в приложении)
Источник питания: для работы с несколькими камерами для электрофореза
требуется многоканальный источник.
Камера для электрофореза: рекомендуется использовать
модели с большим объемом резервуара для буфера и охлаждаемой рабочей
поверхностью.
Водяная баня.
Горизонтальный стол или юстировочный столик с уровнем.
Подогревная электрическая плита (60°С).
Магнитная мешалка с подогревом.
2.2. Лабораторные принадлежности
(список фирм, поставляющих оборудование и материалы, см. в приложении)
Стеклянные пластины 8X8X0,15 см.
Перфораторы для геля - размеры: 1,5 мм (2 мкл), 2,3 мм (5 мкл), 3,0 мм
(10 мкл), 5 мм (30 мкл), 6 мм (40 мкл) (объемы лунок указаны для гелей
толщиной 1,5 мм). Можно использовать вытянутые и ровно обрезанные
стеклянные пипетки или набор пробковых сверл. Кроме того, доступны и
коммерческие наборы перфораторов.
Вакуумный насос с наконечником (пастеровская пипетка) для удаления
вырезанных кусочков геля.
Остроконечный скальпель с рукояткой.
Секционный нож (>8 см).
Металлическая линейка и две подставки 10X1X1 см для вырезания канавок.
Трафареты лунок и канавок (см., например, рис. 6.2, 6.7,
6.10, 6.13, 6.15, 6.16).
Микропипетки с тонкими наконечниками. Во избежание загрязнения образцов
лучше использовать пипетки с одноразовыми наконечниками.
Иммунодиффузия, ИЭФ, иммунохимическое окрашивание 199
Микропипетки с переменным объемом на 10-250 мкл с наконечниками.
Окулярный микрометр для измерения колец преципитации.
Фильтровальная бумага Whatman № 1.
Бумажные полотенца.
Квадратные листы пленки Gelbond (8x8 см) в качестве подложки для геля.
Металлический контейнер для кипячения агаровых гелей.
Чистые пластиковые емкости с крышками (ЮхЮх Х2 ом) для окрашивания и
хранения гелей.
Флаконы из пирекса (50 мл) с крышками (или универсальные стеклянные
флаконы на 20 мл) для приготовленного агарового геля.
Конические колбы из пирекса (2 л) для приготовления исходного раствора
агара.
Градуированные пипетки (10 мл) с грушей или другим аналогичным
приспособлением (например, Pi-pump) (предпочтительнее).
Тонкие стеклянные пастеровские пипетки с резиновой грушей.
Стеклянные пробирки (15 мл) и штатив (для установки в водяную баню).
Пробирки (5 мл) для разведения образцов.
Хирургический бинт для электрофоретических фитилей.
Парафильм.
На рис. 6.1 показано основное оборудование для методов имму.нодиффузии и
ИЭФ.
2.3. Материалы, буферы и реагенты
Агароза - для большинства видов электрофореза требуется агароза с низким
электроэндосмосом, ее же можно использовать для 'реакций диффузии.
Агар - для двойной диффузии в геле (ДДГ) и радиальной иммунодиффузии.
Некоторыми марками можно заменить более дорогую агарозу (см. приложение).
Барбиталовый буфер: 0,05 М, pH 8,6; 0,21 г барбитола (5,5-
Предыдущая << 1 .. 78 79 80 81 82 83 < 84 > 85 86 87 88 89 90 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed