Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Кэтти Д. -> "Антитела. Методы. Книга 1" -> 81

Антитела. Методы. Книга 1 - Кэтти Д.

Кэтти Д., Райкундалия Ч., Браун Дж., Линг Н.Р. Антитела. Методы. Книга 1 — М.: Мир, 1991. — 287 c.
ISBN 5-03-002363-1
Скачать (прямая ссылка): metodikn11991.djvu
Предыдущая << 1 .. 75 76 77 78 79 80 < 81 > 82 83 84 85 86 87 .. 122 >> Следующая

угловым ротором типа 35 и поликарбонатными пробирками на 20 мл или бакет-
ротором SW27 и полиалломерными пробирками на 10 мл.
Центрифугирование продолжают в течение 60 мин при 30 000 об/мин (ротор
типа 35) или 25000 об/мин (ротор SW27). Если приготовлены неочищенные
мембраны, их осадок ресус-пендируют, гомогенизируя в трис-буфере, pH 8, и
хранят в замороженном состоянии. Если же применялось центрифугирование
через "сахарозную подушку", мембраны собирают с поверхности раздела
сахароза-буфер, стараясь при этом захватить минимальный объем
супернатанта. Полученную фракцию разводят трис-буфером, pH 8, осаждают
центрифугированием и вновь суспендируют так же, как и в случае с
неочищенными мембранами. Выход антигенной активности в процентах от ее
содержания в супернатанте для неочищенных мембран
190
Глава 5
приближается к 90%, а для частично очищенных - примерно 60%. Препараты
мембран можно либо сразу солюбилизировать, либо хранить при -40°С.
5.2.5. Солюбилизация мембран дезоксихолатом
1. К препарату мембран в трис-буфере, pH 8 (концентрация белка 3-4
мг/мл), добавляют равный объем 4%-ного раствора дезоксихолата в том же
буфере, содержащем 5 мМ иодо-ацетамида и 0,5 мМ ФМСФ. Важно, чтобы
весовое отношение дезоксихолат: белок было не меньше чем 10:1. Если
необходимо, конечная концентрация дезоксихолата может превышать :2%. В
свое время мы использовали различные концентрации
(вплоть до 5%), но не заметили какого-либо влияния высоких концентраций
детергента на результаты аффинной хроматографии.
2. Экстракт гомогенизируют и затем перемешивают его в течение 60 мин при
4°С. Нерастворившийся материал отделяют ультрацентрифугированием при 70
000 g в течение 60 мин.
3. Супернатант наносят на колонку с иммобилизованными антителами или
замораживают и хранят при -40 °С. После размораживания к препарату нужно
вновь добавить ингибиторы протеиназ (1 мМ иодоацетамида и 0,2 мМ ФМСФ),
перемешать в течение часа и затем центрифугировать, как описано выше.
После размораживания в препарате всегда присутствует некоторое количество
нерастворимого материала, однако потери антигенной активности при
замораживании - оттаивании мы не отмечали.
5.2.6. Непосредственная солюбилизация клеток
в неионком детергенте
Для очистки гликопротеина, в наибольшем количестве содержащегося в
мембранах тимоцитов крысы, был использован описанный ниже метод [41].
1. Тимус измельчают в буфере трис/140 мМ NaCl, pH 8, и доводят
концентрацию тимоцитов в суспензии до 1,5-109 клеток/мл.
2. Добавляют к клеткам 10%-ный (вес на объем) раствор Brij-96 в том же
буфере, содержащем 10 мМ иодоацетамида и 1 мМ ФМСФ (в [41] использовали
диизопропилфторфосфат), так, чтобы конечная концентрация Brij-96
составила 3%. Взвесь гомогенизируют шестью ударами поршня в
гомогенизаторе Поттера - Элвейджема, перемешивают в течение 30 мин, а
затем для удаления клеточных ядер центрифугируют при 6300 g в течение 20
мин.
Иммуноаффинная хроматография
191
3 Добавляют к супернатанту 3%-ный раствор дезоксихолата .натрия в трис-
буфере, pH 8, до конечной концентрации детергента 1%. Концентрация Brij-
96 при этом снизится до 2%. Центрифугируют в течение 60 мин при 70 ООО g.
Супернатант можно сразу нанести на колонку или хранить при -40 °С. При
воспроизведении методики выбирают тот детергент (например, нонидет Р-40,
Lubrol-PX, тритон Х-100 или Brij-96), который обеспечивает максимальное
содержание антигенной активности в супернатанте после
ультрацентрифугирования, определяемой по торможению связывания МКА (см.
разд. 5.1.3).
S.2.7. Солюбилизация гомогената мозга дезоксихолатом
1. Собирают 150 г (по влажному весу) мозговой ткани крыс и измельчают в
гомогенизаторе Уоринга в 600 мл 30 мМ трнс-НС1 буфера, pH 8, содержащего
0,02% NaN3. Затем центрифугируют при 18000 g в течение 60 мин,
супернатант сливают.
2. Осадок суспендируют в 1,25 л 3%-ного раствора дезоксихолата в 30 мМ
трис-HCl буфере, pH 8, содержащем 0,02% NaN3, 1 мМ иодоацетамида, 0,1 мМ
ФМСФ. Затем подвергают краткосрочной обработке сначала в гомогенизаторе
Уоринга, а затем Поттера - Элвейджема (см. разд. 5.2.4).
3. Полученный гомогенат центрифугируют при 18 000 g в течение 60 мин и
собирают супернатант. Осадок вновь гомогенизируют в 200 мл 3%-ного
раствора дезоксихолата и центрифугируют в том же режиме.
4. Экстракты можно сразу же подвергнуть аффинной хроматографии или
заморозить. После размораживания препарат следует отцентрифугировать (при
этом может произойти снижение вязкости).
5.2.8. Выделение антигена ОХ-45 из клеток селезенки
1. Готовят гомогенат ткани селезенки крыс линии Sprague - Dawley в твине-
40 (от 1000 крыс получают около 520 г ткани селезенки) и выделяют
неочищенные мембраны. Солюбилизируют дезоксихолатом натрия, как описано
выше (разд. 5.2.4 и 5.2.5).
2. Для выделения антигена ОХ-45 из дезоксихолатного экстракта применяют
колоночный или бесколоночный метод. Используют 10 мл сефарозы CL-4B, к
которой присоединены антитела к ОХ-45 из расчета 7 мг IgG на 1 мл
Предыдущая << 1 .. 75 76 77 78 79 80 < 81 > 82 83 84 85 86 87 .. 122 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed