Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
Л/Сгпх) двух пиков, соответствующих соединениям с близкой молекулярной
массой. Третий важный параметр, от которого зависит разрешение, -
соотношение между объемом пор (объем, где происходит разделение) и
объемом амежду частицами (где разделения не происходит). Разрешение R
пиков 1 и 2 рассчитывается следующим образом:
R = ^пх,с%х,|. у- (12)
4 V2 1 + Кгп X,2VP/VZ
Сравнительный анализ данных, приведенных на рис. 2.29, с
использованием выражения (12) показывает, что лучшее, чем-на силикагеле,
разрешение, достигаемое на сефадексе, обусловлено большим соотношением
Vp/Vz ("соотношение емкости") - соответственно 1 и 0,8, Большая
эффективность п, достигаемая на колонке с силикагелем (маленькие
частицы), компенсируется меньшим соотношением Vp/Vz.
2.2.8.2. Неподвижные фазы. Для оптимизации процесса разделения по
методу ГПХ необходимы данные о среднем диаметре пор неподвижной фазы,
распределении пор по диаметрам, а также об эффективном объеме пор.
Механически прочные неподвижные фазы используются как с водными, так и с
органическими элюентами, их пористая структура при этом не меняется.
Характеристики неподвижных фаз определяют при помощи универсального
метода ГПХ, используя полистирольные стандарты [27, 77], преимущество
которых - доступность их в виде фракций узкой дисперсности (Р<1,1). На
рис. 2.31 приведены градуировочные кривые, полученные для ряда
силикагелей с применением полистиролов, которые демонстрируют
приемлемость метода и необходимый средний диаметр пор для заданного
интервала молекулярных масс. Такие градуировочные кривые можно получить с
любым другим полимером, если он доступен в виде узких фракций с разными
молекулярными массами, растворимых в выбранных элюентах, и если он не
сорбируется на неподвижной фазе и не вступает с ней в специфические
взаимодействия. Многие водорастворимые полимеры взаимодействуют с
силанольными группами, находящимися на поверхности силикагеля. Ряд фирм
поставляет силикагели с модифицированной поверхностью, пригодные для
биохимического анализа [89].
Модификация силикагелей осуществляется обработкой гли-колями,
ацетиламинопропилсиланами и гидроксилированными силанами. Такие
силикагели поступают в продажу под названиями лихросфер диол, синхропак
GPC, TSK SW, уотерс 1-125, аквопор и т. д. [89-93].
80 Глава 2
Рис. 2.31. Градуировочные кривые, полученные для различных силикагелей.
Неподвижные фазы: лихро-сорб Si 60, Si 100, Si 590, Si 1000; элюеит:
дихлорме-тан; проба: полистиролы.
В водных элюентах градуировку проводят декстранами, сульфированными
полистиролами, полиэтиленгликолями, а также различными белковыми
стандартами. При применении водорастворимых полимеров и неподвижных фаз
на основе силикагеля следует убедиться, что сорбция на поверхности
силикагеля исключена.
2.2.8.3. Оптимизация условий разделения при помощи ГПХ.
Как уже указывалось выше, оставшиеся немодифицированны-ми поверхностные
силанольные группы могут влиять на удерживание, особенно при элюировании
водными растворами. Ионное взаимодействие неподвижной фазы с кислотными
или основными компонентами пробы влияет на их время удерживания (разд.
2.2.4.1). Такие эффекты можно наблюдать и в ГПХ, в первую очередь при
разделении белков. Отклонение от предсказанного порядка элюирования может
наблюдаться также потому, что даже химически модифицированные фазы с
короткими алкильными и полимерными группами обладают некоторыми
гидрофобными свойствами.
Хроматографическая колонка 81
Рассмотрим два различных типа ионных взаимодействий белков с
неподвижной фазой.
а. Белки, заряженные положительно в использованном буферном
растворе (р/>рН), удерживаются по ионообменному механизму, и Ve в данном
случае выше, чем можно было бы ожидать, исходя из размера их молекул.
б. Белки, заряженные отрицательно в использованном буферном
растворе, не могут проникнуть в поры, поскольку этому препятствует
наличие доннановского потенциала [63], и элюируются раньше, чем можно
было бы ожидать.
Заряд белков меняют, варьируя pH буферного раствора. Однако если
ферментативную активность их необходимо сохранить, то такой способ
оптимизации условий разделения имеет ограниченное применение.
Ионное взаимодействие уменьшают, пользуясь законом действующих масс,
путем добавления в буфер нейтральных солей. Этот же прием используют в
ИОХ (разд. 2.2.6.2). Рис. 2.32 демонстрирует влияние ионной силы элюента
на разделение различных белков. Увеличение ионной силы до 0,3 достаточно
для подавления ионо-эксклюзионного эффекта. При таком значении ионной
силы отрицательно заряженные белки элюируются в соответствии с их
молекулярными размерами. Для снижения ионообменного взаимодействия
положительно заряженных белков с неподвижной фазой необходимо, чтобы
ионная сила элюента равнялась примерно 0,5. Однако следует заметить, что
увеличение ионной силы вызывает увеличение удерживания гидрофобных
