Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
глицидилоксипропильными группами проводят разделение методом ГПХ белков
(разд. 2.2.8). Очень сильное взаимодействие разделяемых соединений с
функциональными группами неподвижной фазы характерно для ИОХ (разд.
2.2.6). На примере этих систем можно также показать, как гидрофобность
неподвижной фазы влияет на удерживание при наличии сильного ионного
взаимодействия.
В данном случае легко установить различие между ожидаемой и
действительной селективностью. Для других функциональных групп обнаружить
селективность гораздо сложнее, поскольку трудно получить идентичное
покрытие поверхности неподвижной фазы при ее модифицировании
соответствующими силанами. Различие в гидрофобной селективности, в
степени модифицирования поверхности и соответственно в концентрации
силанольных групп осложняет непосредственное сопоставление свойств
неподвижной фазы и вида привитых функциональных групп. Селективность
неподвижных фаз, например с цианопро-пильными или фенильными привитыми
группами обусловлена не только наличием этих групп, но и различием в
гидрофобности, полярности и (или) степени покрытия поверхности.
Хроматографическая колонка 85
Очень трудно объяснить, чем это вызвано, но неподвижные -фазы с
привитыми аминогруппами, выпускаемые различными поставщиками, обладают
сходными свойствами, тогда как нит-рильные фазы очень различаются [99].
Сравнивать свойства различных привитых фаз или описывать их поведение при
использовании различных элюентов не имеет смысла. В хроматографии
оценивается селективность всей хроматографической системы в целом, т. е.
неподвижной фазы, элюента и разделяемых соединений [32].
Поэтому ниже будут приведены только такие примеры применения
неподвижных фаз с привитыми функциональными группами, в которых очевидна
взаимосвязь селективности и вида функциональной привитой группы.
2.2.9.1. Фазы, участвующие в переносе заряда. Разделение
ароматических углеводородов проводят на неподвижных фазах с привитыми
нитрофенильными [2, 100], нитрофтореноновыми и тетрахлорфталиевыми
кислотными [101] группами. При элюировании неполярными элюентами такие
неподвижные фазы по селективности превосходят немодифицированный
силикагель.
2.2.9.2. Аминофазы. Селективность неподвижных фаз с привитыми
пропиламиногруппами при разделении ароматических углеводородов путем
элюирования неполярными элюентами существенно отличается от селективности
немодифицированных силикагелей [2, 102]. В воде аминофазы проявляют
свойства слабого анионообменника, тогда как в водно-ацетонитрильных
смесях вполне пригодны для разделения сахаров [103, 104]. На рис. 2.34
приведен пример разделения сахаров и их спиртов на аминофазе. Разделение
происходит по распределительному механизму ГЮ5], и поэтому аминогруппы не
принимают непосредственного участия в удерживании сахаров. Неподвижная
фаза обогащается водой из элюента, разделение происходит в результате
распределения разделяемых соединений между обогащенной водой фазой и
элюентом. По такому же механизму происходит разделение сахаров на
ионообменных смолах при элюировании водным раствором метанола [80]. Если
к неподвижной фазе привиты диаминогруппы, содержание воды внутри
неподвижной фазы увеличивается от 0,13 (моноаминогруппы) до 0,23 г/г.
Если разделение проводится на диаминовой фазе, содержание воды в элюенте
должно быть выше, чтобы коэффициент емкости имел то же значение, что и
для моноаминофазы. Увеличение содержания воды в элюенте способствует
разделению, поскольку увеличивает растворимость сахаров.
На рис. 2.35 приведена зависимость коэффициента емкости от
концентрации ацетонитрила в элюенте для моно-, ди- и триаминофаз.
Модифицирование неподвижной фазы силаном,
5
.
Рис, 2.34. Разделение сахаров и их спиртов и"
привитой аминофазе [105].
Неподвижная фаза: амино-силаи иа лихросорбе Si 100; элюеит:
ацетоиитрил/вода
(80/20 по массе).
/ - дезоксирибоэа; 2 -рам-иоза; 3 - мезоэритроза; 4 - арабииоза; 5 -
фруктоза; 5 - маияоэа; 7 -сорбитоза; Н - маяиитоза.
Рис. 2.35. Сравнение различных аминофаз на примере удерживания фрукто-зы
(1), глюкозы (2), сахарозы (3),
Неподвижная фаза: ¦ ¦- амиио, ..........диамино,--------- триамино;
элюент; во-
да/ацетонитрнл.
Хроматографическая колонка 87
содержащим три аминогруппы, оказывает лишь незначительное дополнительное
влияние на увеличение содержания воды в неподвижной фазе, а
следовательно, и на разделение сахаров [105].
Диаминофаза, будучи слабым ионообменником, используется для разделения
полиэтиленгликолей при элюировании водой [91]. Следует отметить, что
полиэтиленгликоли прочно удерживаются не только обращенной фазой, но и
немодифици-рованным силикагелем [98]. Неподвижные фазы для ГПХ белков,
например с привитыми амидными или гликолиевыми группами, также прочно
удерживают полиэтиленгликоли. Приведенный пример-¦ еще одно свидетельство
того, что селективность неподвижной фазы зависит от целого ряда
