Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Хеншен А. -> "Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии" -> 27

Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.

Хеншен А. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии — М.: Мир, 1988. — 688 c.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка): visokoeffektivnayajidkostnayahromatograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 21 22 23 24 25 26 < 27 > 28 29 30 31 32 33 .. 296 >> Следующая

фосфатных буферных растворах может вызывать дрейф нулевой линии, если
обнаружение проводят при длине волны 254 нм. Состав буфера влияет также
на селективность разделения. Как и в адсорбционной хроматографии,
элюирующая способность катионов и анионов увеличивается с увеличением
прочности их сорбции на данном ионообменнике, например при разделении
аминокислот литий-цитратный буфер - более слабый элюент, чем натрий-
цитрат-ный. В классической ИОХ существуют ряды анионов и катионов,
определяющие изменение элюирующей способности. Для сильных ионообменников
элюирующая способность анионов уменьшается в следующем ряду:
цитрат>оксалат>1->
>HS04->N03~>Br->С1~>формиат > ацетат > ОН~ > F-. Элюирующую силу катионов
для сильных катионообменников характеризует такой ряд:
Fe3+>Ca2+>Cu2+>Zn2+>Mg2+>-
>Ag+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Cu+.
В заключение отметим, что на селективность разделения может оказывать
влияние специфическое взаимодействие разделяемых соединений с катионами
или анионами, приводящее к комплексообразованию.
2.2.6.3. Ионообменная хроматография аминокислот. Аминокислоты в виде
цвиттер-ионов не удерживаются на ионообменнике, поскольку не участвуют в
ионном обмене, но разделить их на катионообменнике можно, используя
различие в их изоэлектрических точках. На рис. 2.24 приведена зависимость
коэффициента емкости от pH элюента [79]. Разделение смеси, содержащей все
известные аминокислоты, возможно только при элюировании в градиенте pH.
(Возможности градиентного элюирования обсуждаются в разд. 2.2.7.)
Обнаружение аминокислот сопряжено с определенными трудностями, так как
они не обладают специфической способностью к поглощению света в УФ-
области спектра. В классическом ионообменном анализе аминокислот
обнаружение осуществляется колориметрическим методом по реакции с
нингидрином,
Хроматографическая колонка 69
Рис. 2.24. Удерживание аминокислот при различных pH.
Неподвижная фаза: катиоиообменник на основе силикагеля; элюент: натрий-
цитратный буфер, ионная сила 0,1.
которая проводится после разделения [81, 82]. Для ВЭЖХ, однако, реакция с
нингидрином не пригодна, так как протекает слишком медленно, что приводит
к уширению пиков, поэтому в ВЭЖХ для обнаружения применяют иные принципы
и реакции [83-86]. Применение механически прочных ионообменников для
разделения и высокочувствительных и селективных реакций для обнаружения
позволяет проводить весьма эффективное разделение аминокислот и пептидов,
содержащихся, например, в моче. Нижний предел обнаружения при помощи
реакции с фталевым альдегидом (детектор по флуоресценции) составляет
несколько пикомолей [86]. На рис. 2.25 показано хроматографическое
разделение аминокислот мочи человека. Объем анализируемой пробы составлял
25 мкл; какой-либо предварительной обработке проба не подвергалась.
Выбранная хроматографическая система позволяет проводить разделение и
обнаружение всех находящихся в моче соединений, содержащих первичную
аминогруппу.
2.2.7. Градиентное элюирование
На силикагелевых неподвижных фазах при помощи обращенно-фазовой или
ионообменной хроматографии в изократическом режиме хорошо разделяются
только такие соединения, которые значительно отличаются друг от друга по
полярности. Разделение неполярных соединений или соединений с близкой
полярностью можно провести при программируемом изменении элюирующей
способности элюента или, иными словами, при
70
Глава 2
Рис. 2.25. Определение аминокислот в моче человека при градиентном
элюировании и обнаружении на основе химической реакции.
Неподвижная фаза: ионообменник на основе силикагеля; элюеит; А - цитрат
лития. pH 2,0, /=0,1 М, Б- цитрат лития, pH 7,5, /-0,1 М;
программирование состава элюента: от 0 до 50 мин, повышение концентрации
компонента Б от 5 до 35%, последующее повышение объемной скорости 1,0
мл/мин, далее от 50 до 55 мнн, последующее повышение концентрации Б при
объемной скорости 2,0 мл/мин, после 55 мин 100% Б, I-0,5, объемная
скорость 2,0 мл/мин; обнаружение: по реакции с фталевым ангидридом в
боратном буфере, pH 10,0; реактор; трубка 900X0.05 см (йнутр. диаметр);
объемная скорость реагента: 1,0 мл/мин; время реакции: 40-60 с,
температура реакции: 30 °С.
градиентном элюировании, которое позволяет также существенно уменьшить
длительность разделения и ширину пиков. Однако разделение зон при
градиентном элюировании всегда несколько хуже, чем при изократическом [2,
87], но это не представляет собой проблемы, так как разделение зон
остается на достаточно высоком уровне.
Хроматографическая колонка 71
Отметим следующие возможности оптимизации условий градиентного
элюирования (не учитывая выбор неподвижной фазы): состав элюента в начале
разделения, форма градиента, состав элюента в конце разделения, объемная
скорость, программирование времени.
2.2.7.1. Выбор условий градиента. Выбор неподвижной фазы
определяется свойствами разделяемой смеси. Выбор компонентов элюента и их
Предыдущая << 1 .. 21 22 23 24 25 26 < 27 > 28 29 30 31 32 33 .. 296 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed