Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
пробы
90 Глава 2
Таблица 2.5. Выбор хроматографической разделительной системы в
соответствии со структурными параметрами разделяемых соединений
Структурный параметр Адсорбци Распре Ионо Гель-про-
онная делитель обмен инкающая
Si02 обра
щен
ная
фаза
Размер ( + ) + + + +
Гомологические ряды ++ ++ (+>
Изомеры: ++ ++
конформацнонные Н---h +
положения (+) ++ ( + )
пространственные С добавками или
оптические специальные привитые фазы
Тип и число заместителей:
алкильные группы (+> ++ н---ь
неполярные группы (ароматиче ++ + + +
ские, двойные связи, галогены)
группы средней полярности (нит- ++ + +
ро-, сложноэфнрные)
полярные (фенольные, спиртовые, + ++ (+)
амидные) Предпочтительно ИПХ
диссоциирующие группы, кисло ИПХ (г)
ты, основания
соединений. Оптимальным вариантом является такая система, которая
позволяет осуществить необходимое разделение компонентов смеси за
кратчайшее время в простых и легко контролируемых условиях.
Разделение водорастворимых проб лучше проводить методом обращенно-
фазовой хроматографии. Удерживание увеличивается с увеличением
гидрофобности соединений, т. е.( иными словами, с уменьшением их
растворимости в воде. Элюирование осуществляют, добавляя органические
смешивающиеся с водой растворители в водные элюенты. Полярные соединения
могут давать асимметричные и искаженные пики. Введение в элюент правильно
выбранного противоиона увеличивает'эффективность и влияет на
селективность системы (см. раздел, посвященный ион-парной хроматографии).
Ионогенные соединения успешно разделяют при помощи ионообменной
хроматографии. Разделение в этом случае происходит благодаря ионному
воздействию растворенных соединений и неподвижной фазы. На удерживание
влияют pH и ионная сила водного элюента. При этом не исключена
возможность гидрофобных взаимодействий, которые можно контролировать по
правилам обращенно-фазовой хроматографии. В системах указанного типа
наблюдается заметное взаимодействие раство-
Хроматографическая колонка 91
Мол. масса 500 ООО
Мол. масса 600
Рис. 2.38. Эксклюзия и
сорбция декстранов и ии-лиэтиленгликоля на гликофазе [98 J.
Неподвижная фаза: гликоль на лихросорбе Si 100; элю-ент; вода; проба:
декстраны с мол. массой 10 000 и 500 000, раффиноза (мол. масса 595),
полиэтиленглн-коль (мол. масса 600); инертное соединение: D20.
ренных соединений и неподвижной фазы. Сорбция разделяемых соединений на
неподвижной фазе, особенно в условиях обра-щенно-фазовой хроматографии,
приводит к структурным изменениям молекул, например разворачиванию
белковых цепей. Для элюирования гидрофобных веществ могут потребоваться
элюенты с довольно высоким содержанием органического компонента,
что также может повлиять на структуру белков и,
следовательно, на их биологическую активность. Качественный и
количественный анализы пептидов и белков целесообразно проводить по
методу обращенно-фазовой хроматографии в условиях градиентного
элюирования. Чтобы избежать искажения пиков, в элюент можно ввести
противоионы. Однако при препаративных разделениях это существенно
затрудняет получение чистых компонентов.
Разделение по механизму ГПХ, согласно определению, предполагает
отсутствие взаимодействия между разделяемыми соединениями и неподвижной
фазой. Разрушение растворенных веществ должно быть минимальным.
Разделение же их обусловлено лишь различиями в размерах молекул. Число
пиков на гель-хроматограммах в принципе ограничено.
Итак, для анализа биологических объектов наибольший интерес
представляет обращенно-фазовая хроматография, однако опасность
структурных изменений белков и ферментов при этом также велика.
Вероятность структурных изменений минимальна при разделении методом ГПХ,
но его разделительная способность оставляет желать лучшего.
92 Глава 2
2.2.11. Соединение разделительных систем (система с распределением потока
по колонкам)
Для улучшения разрешения бывает целесообразно разделить смесь на
нескольких различных неподвижных фазах. С этой целью различные
