Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
соединений (см. трипептид (РЬе)з и динитрофенилаланин на рис. 2.32).
Кроме того, как уже отмечалось выше, увеличение ионной силы приводит к
высаливанию гидрофобных соединений. Обсуждаемые изменения состава
элюента, позволяющие уменьшить ионное взаимодействие с неподвижной фазой,
приемлемы для ГПХ на силикагелях [90].
Биохимикам хорошо известно, что белки денатурируют при изменении pH,
высаливании, а также в результате гидрофобного взаимодействия. Поэтому
выбирать условия хроматографического. разделения следует очень тщательно
и при замене колонки проверять их. Если разделение проводится в указанных
выше условиях, выход белков всегда превышает 90% даже при небольшом их
запаздывании. Ионное взаимодействие наблюдается также при разделении
белков гель-фильтрацией на сефа-дексе, поскольку на его поверхности могут
содержаться карбоксильные группы [94]. Отметим в заключение, что ионная
сила элюента не должна значительно превышать 0,5 [90].
2.2.8.4. Корреляция между объемом элюирования, молекулярной массой и
молекулярными размерами. Одно из преимуществ колоночной ГПХ на силикагеле
заключается в том, что
6-1489
82
Глава 2
Рис. 2.32. ГПХ пептидов и белков: зависимость объема элюирования от
ионной силы [92].
Неподвижная фаза: с привитыми амидными группами; элюент: 0,1 М трис-НС1-
буфер, pH 7.5: ионную силу изменяли путем добавления NaCl.
1 - трифениламцн; 2 - динитрофенилаланин; 3 - фенилаланин; 4 -
химотрипсиноген; 5 - цитохром с; 6 - миоглобнн; 7 - овальбумин; 8 - BSA;
9 - каталаза; 10 - ферритии; 11 - бензол.
элюент не влияет ни на диаметр пор силикагеля, ни на их объем. Поэтому
можно отградуировать колонку при помощи полистирольных стандартов,
элюируя их дихлорметаном, а затем проводить на этой колонке разделение
белков или водорастворимых полимеров, элюируя их водой или водными
буферными растворами.
Если полимеры существуют в растворе в виде статистических клубков, то
размеры последних определяются относительной молекулярной массой
полимеров [95], а также степенью их
Хроматографическая колонка 83
Рис. 2.33. Корреляция между объемами элюирования белков и полистиролов
(объяснения см. в тексте) [92].
сольватации. Для получения универсальной градуировочной кривой в химии
полимеров рекомендуется умножить молекулярную массу полимера на его
характеристическую вязкость, что позволяет учесть различие в степени
сольватации [96].
На рис. 2.33 приведены градуировочные кривые, полученные для
колоночной системы с модифицированным силикагелем с использованием
полистирольных стандартов (элюент - дихлор-метан), декстранов (вода) и
белков (буферный раствор). Корректировка, учитывающая различие в
молекулярной структуре стандартов, в данном случае не проводилась.
Декстраны отличаются гораздо большей плотностью, чем полистиролы
идентичной молекулярной массы, т. е. объем статистического клубка
молекулы декстрана намного меньше, и, следовательно, их объем элюирования
больше. Белки существуют в растворе в различной форме, определяемой
последовательностью аминокислот. Третичная (надмолекулярная) структура
белков гораздо более компактна, чем структура статистического клубка.
Белки элюируются при большем Ve, чем полистиролы или дек-страны такой же
молекулярной массы [92]. Молекула миогло-бина, молекулярная масса
которого относительно невелика (17 800), имеет форму эллипсоида с большей
осью 4,4 нм. Такие же размеры имеет молекула полистирола с молекулярной
массой 6700, существующая в форме статистического клубка [27]. Если
провести корректировку молекулярной массы белков
6*
84 Глава 2
с учетом их размеров, то градуировочная кривая по белкам практически
совпадет с таковой по полистиролам (указано стрелками на рис. 2.33). Этот
факт подтверждает, что специфическое удерживаиие белков на неподвижной
фазе отсутствует и что их разделение проходит по механизму гель-
проникающей хроматографии. Следует отметить, что ГПХ используют и для
решения обратной задачи: определения стоксова радиуса неизвестных белков
по градуировочной кривой для полистиролов [97]. Белки, имеющие одинаковую
молекулярную массу, могут иметь различную геометрию надмолекулярной
структуры и поэтому отличаться по объему элюирования.
2.2.9. Неподвижные фазы, имеющие функциональные группы
Силикагель реагирует с алкилсиланами, а также с силанами, имеющими
функциональные группы на органической "ножке", соединенной с атомом
кремния. Введение функциональных групп в уже привитые к поверхности
органосиланы затруднено и никогда не дает неподвижных фаз с хорошими
воспроизводимыми свойствами [98]. Оценить, какой специфический вид
селективности приобретает неподвижная фаза после введения функциональных
групп, очень трудно. Все привитые фазы гидрофобны. Привитые фазы,
гидрофобность которых после введения функциональных групп снижается,
используются как неподвижные фазы в ГПХ в сочетании с водными элюентами.
На неподвижных фазах с привитыми N-ацетиламинопропильны-ми или
