Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
концентрация на выходе из колонки еще не достигнута (т. е. разделение и
элюирование еще не завершены), а приборы уже ее фиксируют. Стартовая
точка, фиксируемая УФ-детектором, соответствует 0% компонента Б на выходе
из колонки, конечная-100% компонента Б, следовательно, расстояние между
этими точками равно интервалу от 0 до 100%. Исходя из этого, можно
определить состав элюента на выходе из колонки. Найденная концентрация
элюента при условии соответствия градиентного объема требуемому может
быть использована для выбора оптимального состава элюента для
изокрэтического элюирования.
2.2.8. Гель-проникающая хроматография (ГПХ)
Гель-проникающая хроматография в отличие от рассмотренных ранее видов
хроматографии имеет в своей основе единый, не допускающих других
трактовок механизм разделения. В отсутствие специфических взаимодействий
пробы и неподвижной фазы (что соответствует определению метода) порядок
элюирования во всех случаях является функцией размера молекул. Для
синтетических неразветвленных полимеров, существующих в растворе в виде
статистического клубка, размеры молекул можно непосредственно связать с
молекулярной массой. Для молекул с упорядоченной структурой обычно
используемая зависимость десятичный логарифм молекулярной массы - объем
элюирования не вполне описывает их хроматографическое поведение в
условиях ГПХ.
ГПХ называют также гель-фильтрацией или гель-эксклюзи-онной
хроматографией. Получаемые на основе сшитых полимеров гели, чья пористая
структура формируется в процессе набухания в элюенте, непригодны для
ВЭЖХ. Структура насадки и, следовательно, пористая структура зависят от
степени сши-тости геля и состава элюента. При объемных скоростях, обычно
используемых в ВЭЖХ, насадки и мягкие гели сжимаются. Поэтому в
современной ВЭЖХ применяются полужесткие органические гели и прочные
неподвижные фазы на основе силикагелей с частицами малого диаметра. Рис.
2.29 демонстрирует на примере разделения декстранов преимущества
современной ГПХ над гель-фильтрациоиной хроматографией. Приме-
'Хроматографическая колонка 77
Рис. 2.29. ГПХ на мягких гелях и на силикагеле.
А - неподвижная фаза: сефадекс G 50 (тонкодисперсный); колонка: 37,1X2,1
см; объемная скорость; 2 мл/мин: элюент: вода; проба: декстраны
молекулярной массы 70 000 (а), 40 000 (б), 10 000 (в), 5000 (г) и ксилоза
(д).
Б - неподвижная фаза: кизельгель Si 100 (10 мкм); колонка 25X0.41 см;
объемная скорость: 1 мл/мян; элюент и проба те же.
нение механически прочных силикагелей с частицами малого диаметра
уменьшает время разделения примерно в 20 раз, а скорость разделения
(число теоретических тарелок в секунду) на неподвижных фазах на основе
силикагеля увеличивается в 400 раз.
2.2.8.1. Основы ГПХ. Объем элюирования Ve полимера должен
зависеть не только от размера его молекул в растворе, но и от характера
распределения пор неподвижной фазы по размерам. Мертвый объем колонки VM
определяют как объем элюирования молекул элюента или иного
низкомолекулярного соединения, не взаимодействующего с поверхностью
неподвижной фазы, но проникающего во все ее поры, включая поры
наименьшего диаметра. Методы определения VM и tM приведены в табл. 2.2
(разд. 2.1,3), Объем VM состоит из объема между частицами неподвижной
фазы V% и объема пор Vp неподвижной фазы. Vz определяют как удерживаемый
объем полностью исключаемых молекул с большой средней молекулярной
массой, не проникающих в поры и идентичных по свойствам разделяемым
молекулам. В зависимости от характера распределе-
78
Глава 2
Рис. 2.30. Пример разделения ме*
тодом ГПХ полистиролов с молекулярной массой от 2100 до 2 600 000
(наименьшей молекулой служил беизол) (а) н градуировочная кривая,
построенная по результатам указанного разделения (б) [2].
Неподвижная фаза: силикагмь; мв-
ент: дихлорметан.
ния пор неподвижной фазы по диаметрам и размера молекул разделяемого
вещества доступной для последнего может быть только часть пор. Объем
элюирования компонента разделяемой смеси равен
Ve=Vz+KrnxVP (И)
где KYnx-коэффициент, отражающий долю (часть) объема пор, доступных
данному компоненту смеси. Согласно определению, /Сгпх не превышает
единицы (Os^/Crnxsg: 1). Таким образом, объем элюирования меньше или
равен Vm, поэтому момент, окончания процесса разделения всегда можно
предсказать Напротив, в хроматографии, в основе которой лежит принцип
удерживания, объем элюирования VR удерживаемого соединения больше Vm (VR-
VM(l-\-k)). На рис. 2.30 показаны соотношения Ve, Vz и Vp и 1 gMw,
характеризующие распределение пор в неподвижной фазе по диаметрам [27].
Разрешение пиков в ГПХ (как и в хроматографии на основе
удерживания) зависит от эффективности колонки и выражается
Хроматографическая колонка 79
числом теоретических тарелок при заданной объемной скорости. Чем меньше
наклон прямой в координатах lgMw-Ve, тем лучше разрешение (ДУе или
