Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
соотношение в начале и конце элюирования зависит от различия в полярности
разделяемых соединений. Выбор оптимальных условий градиентного
элюирования позволяет получить хорошее разрешение пиков, элюирующихся
первыми, а также уменьшить до разумных пределов длительность элюирования
наиболее сильно удерживаемых компонентов.
Изменение концентрации компонента элюента во времени может
представлять собой прямую либо выпуклую или вогнутую кривую. Линейная
форма градиента предпочтительна особенно в ВЭЖХ и ИОХ. Реальная
(эффективная) форма градиента лишь отчасти зависит от той формы, которая
задается программой. Форма градиента представляет собой функцию,
зависящую от различия в элюирующей способности двух компонентов элюента.
Если два растворителя существенно отличаются по элюирующей способности
(полярности), то добавление небольшого количества одного из них
(например, полярного) к другому вызывает сильное изменение элюирующей
способности, соответственно форма градиента будет иметь вид выпуклой
кривой. Такую форму выбирают относительно редко, так как в этом случае в
начале разделения пики на хроматограмме будут находиться очень близко
друг от друга.
Линейное увеличение элюирующей способности представляется оптимальным
для разделения соединений одного гомологического ряда: в этом случае
соединения элюируются примерно через одинаковые интервалы, причем ширина
пиков меняется незначительно. Это обеспечивает примерно одинаковый предел
обнаружения для всех компонентов разделяемой смеси. В об-ращенно-фазовой
хроматографии линейное увеличение элюирующей силы осуществляют путем
линейного увеличения содержания органического компонента, например
метанола или ацетонитрила, в воде. На рис. 2.26 на примере фенилациловых
эфиров жирных кислот показано влияние увеличения элюирующей способности
элюента при градиентном элюировании. При введении в элюент метанола
расстояние между пиками жирных кислот, расположенных рядом в одном
гомологическом ряду, постепенно уменьшается с увеличением элюирующей
способности элюента. В то же время при элюировании элюентом, в который
вводится ацетонитрил, расстояния между пиками примерно
72 Глава 2
Рис. 2.26. Разделение фенациловых эфиров жирных кислот в условиях
линейного градиента элюирующей способности элюента [1171.
Градиент: от 70 до 100% Б; градиентный объем: 40 мл. а: Б- метанол; 6: Б
- ацето-питрил.
одинаковы. В начале элюирования (при высоком содержании компонента Б)
расстояние между пиками несколько меньше, тогда как на последних этапах
элюирования (после достижения конечной концентрации добавки) оно вновь
увеличивается. Если в качестве органического компонента используется
более сильный элюент, например пропанол, общая элюирующая способность
увеличивается таким образом, что кривая элюирования имеет, по крайней
мере вначале, выпуклую форму. В ионообменной хроматографии, где
используют градиент pH или ионной силы, настоятельно рекомендуется
линейная форма градиента. Если основу неподвижной фазы составляет
силикагель, а градиент формируют, добавляя гексан или дихлорметан, то
линейное увеличение элюирующей способности можно получить, используя
слегка вогнутый градиент. После выбора формы градиента и условий его
формирования необходимо оптимизировать объемную скорость и
программирование времени. Произведение этих переменных или градиентный
объем Vg представляет собой объем элюента, прошедшего через систему в
процессе программируемого разделения.
2.2.7.2. Концепция градиентного объема. Если градиентный объем
сохраняется постоянным, то независимо от изменения объемной скорости и
длительности разделения определенные
Хроматографическая колонка 73
компоненты разделяемой смеси элюируются при вполне определенном и
постоянном для конкретного компонента составе элюента [88], являющегося
функцией градиентного объема. Чем больше градиентный объем, тем меньше
содержание компонента Б в элюенте, при котором элюируется определенный
компонент. Градиентный объем для обычной аналитической колонки (длина 25-
30 см, внутренний диаметр 0,4 см) не может быть менее 10 мл или, если его
выразить в объемах пустой колонки, примерно 2,5 объема пустой колонки.
Число компонентов, которые можно разделить при таком сравнительно малом
градиентном объеме, также мало. Если колонка заполнена частицами размером
10 мкм, допустимое число компонентов смеси равно примерно 30. Для
разделения многокомпонентной смеси необходимы существенно большие
градиентные объемы, равные 30 объемам пустой колонки. В такой системе
несложна разделить смесь, состоящую из 100 компонентов. При оптимальной
объемной скорости, например 2 мл/мин, время разделения смеси из 100
компонентов составляет 60 мин. При градиентном объеме, равном 10-15
объемам пустой колонки, можно разделить смесь из 70 компонентов.
Объем, соответствующий выходу того или иного пика, зависит от объемной
скорости. Особенности хроматографического оборудования ограничивают
