Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
минимальное значение объемной скорости. Скорость, равную 2 мл/мин,
считают оптимальной, при меньшей скорости точность работы насосов
недостаточна. Увеличение объемной скорости от 1 до 2 мл/мин уменьшает
объем фракций, соответствующих пикам (при постоянном градиентном объеме)
на 10%, однако длительность анализа уменьшается вдвое. При объемной
скорости более 4 мл/мин возникают проблемы, связанные с
невоспроизводимостью результатов, смешиванием компонентов элюента при
создании градиента.
Используя понятие "градиентный объем", можно достаточно быстро
определить оптимальный состав элюента для изократи-ческого элюирования. С
этой целью необходимо установить состав элюента, при элюировании которым
проба при заданном градиентном объеме вымывается из колонки за один цикл.
При этом следует учитывать, что вследствие наличия мертвого объема в
системе в целом и непосредственно в хроматографической колонке
эффективный состав элюента на выходе из колонки всегда немного (на
несколько миллилитров) отличается от показываемого приборами. Способ
определения состава элюента на выходе из колонки обсужден в разд.
2.2.7.3. Если для изократического элюирования использовать элюент такого
состава, при котором определенный пик вымывается за один цикл,
коэффициент емкости равен примерно 1 (если градиентный объем составляет
примерно 5-15 объемов пустой колон-
74
Глава '2
Рис. 2.27. Хо.юстой опыт по ipa-диентному элюированию в условиях
обращенно-фазовой хроматографии с различными партиями коммерческого
метанола (неподвижная фаза С18).
ки). Более высокое значение k наблюдается при больших градиентных
объемах.
2.2.7.3. Практические аспекты градиентного элюирования.
Хроматографическое оборудование для градиентного элюирования обсуждается
в разд. 2.3. Особые требования предъявляют к чистоте растворителей.
Разделяющая колонка служит своеобразным коллектором примесей,
содержащихся в растворителях, которые могут элюироваться в виде четких
пиков, чаще всего на завершающих этапах программируемого изменения
состава элюента, что может служить причиной ошибочной трактовки
хроматографических данных. Поэтому перед разделением целесообразно
провести холостой опыт, т. е. градиентное элюирование без введения в
колонку пробы. Рис. 2.27 иллюстрирует данные таких экспериментов,
осуществляемых с использованием различных партий метанола f88]. На
колонке удерживаются не только те примеси, которые содержатся в стартовом
(более слабом) компоненте элюента, но и примеси, содержащиеся во втором,
более сильном компоненте, причем последние элюируются на заключительном
этапе разделения. Количество сорбированных примесей зависит также от
времени, в течение которого после завершения одного цикла и перед началом
другого через колонку прокачивают элюент, поэтому это время следует
поддерживать постоянным. Кроме того, холостое гра-
Хроматографическая колонка
75
Рис. 2.28. Контрольные эксперименты по формированию профиля градиента при
помощи двух видов коммерческого оборудования.
1 - профиль, полученный на основании данных электрон* ного датчика; 2 -
истинный профиль градиента иа выходе из колонки.
диентное элюирование необходимо повторять в тех случаях, когда меняется
партия растворителя.
Регенерация колонки, т. е. восстановление в ней начальных условий
путем удаления полярного компонента элюента, при использовании
неподвижной фазы на основе силикагеля требует длительного времени.
Регенерация колонок, заполненных химически привитыми фазами, достигается
после пропускания через нее по крайней мере 10 объемов элюента, равных
объему пустой колонки. Время регенерации также должно быть
стандартизовано из-за возможного концентрирования в колонке примесей,
содержащихся в воде или метаноле.
В целях проверки работы оборудования и определения таких параметров,
как действительный профиль градиента, запаздывание градиента,
обусловленное наличием мертвого объема, состав элюента на выходе из
колонки, рекомендуется следующая методика.
Хроматографическую систему, включая колонку, следует привести в
рабочее состояние. В качестве компонента А элюента следует использовать
чистый метанол, а компонента Б - метанол, содержащий примерно 1 • 10-2 %
толуола в качестве УФ-метки. Концентрация толуола выбрана так, чтобы при
стандартном диапазоне чувствительности УФ-детектора (0- 0,5 ед.
поглощения всей шкалы) можно было наблюдать градиент в интервале 0-100%
компонента Б. На рис. 2.28 приведены
76 Глава 2
градиенты, полученные при помощи двух различных типов промышленного
хроматографического оборудования. Внизу показан типичный градиент
высокого давления создаваемый с применением двух насосов, вверху -
градиент низкого давления, формируемый с использованием одного насоса и
смесительной камеры до ввода элюента в насос (в последнем случае
происходит деформация заданной формы градиента). Из этого рисунка можно
определить запаздывание градиента в колонке. Конечная программируемая
