Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Хеншен А. -> "Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии" -> 26

Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.

Хеншен А. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии — М.: Мир, 1988. — 688 c.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка): visokoeffektivnayajidkostnayahromatograf1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 20 21 22 23 24 25 < 26 > 27 28 29 30 31 32 .. 296 >> Следующая

всего вдвое меньше, чем у соответствую-
Хроматографическая колонка
65
Рис. 2.21. Удерживание монофосфатов на анионооб-менннке.
Неподвижная фаза: четвертичный аммониевый катион в форме хлорида; элюент:
фосфатный буфер (/="0,1 М); проба: / - ГМФ, 2 - АМФ, 3 - ЦМ.Ф, 4 - УМФ.
щих колонок, заполненных сорбентом на основе полистирола. В настоящее
время выпускаются материалы на основе силикагеля с обменной емкостью от
0,1 до 1 ммоль/r (все данные отнесены к 1 ионному эквиваленту). На
селективность ионообменной системы оказывает влияние ионная эксклюзия,
обусловленная существованием потенциала Доннана [63], а также гидрофобным
взаимодействием между разделяемыми соединениями и органической матрицей.
Чем больше емкость ионообменника, тем, очевидно, больше коэффициент
емкости. На рис. 2.20 приведена зависимость k от pH, полученная при
разделении пуриновых и пиримидиновых оснований на катионообменнике [79].
При низких значениях pH протонированные аммониевые группы могут
взаимодействовать с кислотными сульфоновыми группами сорбента. Наибольшие
изменения k наблюдаются при значениях pH, лежащих вблизи pKi оснований.
Урацил и тимин не ионизируются в том диапазоне pH, который приведен на
рис. 2.20, поэтому они не удерживаются ионо-обменником. Удерживание этих,
а также поддающееся измерению удерживание других оснований при высоких
значениях pH происходит вследствие гидрофобного взаимодействия с
органическими группами, привитыми к поверхности силикагеля.
Зависимость от pH удерживания нуклеотидов (монофосфатов) на сильном
анионообменнике, содержащем четвертичные
66 Глава 2
Рис. 2.22. Зависимость коэффициента емкости от ионной силы (условия те
же, что на рис. 2.21); pH 7,0; необходимая ионная сила достигалась в
результате добавлевия соответствующего количества NaCl.
аммониевые группы, показана на рис. 2.21 [79]. При низких величинах pH
фосфат протонирован и не взаимодействует с четвертичными аммониевыми
группами. С увеличением pH фосфат диссоциирует, и нуклеотиды удерживаются
на неподвижной фазе. При pH около 7 увеличивается количество гидроксидных
групп, конкурирующих с фосфатными в процессах ионного обмена. Гидроксид-
ионы вытесняют молекулы разделяемых соединений с поверхности
ионообменника, что приводит к уменьшению коэффициента емкости по
нуклеотидам. Нуклеотиды этих трех групп легко разделяются при помощи ИОХ,
поскольку дифосфаты удерживаются сильнее, чем монофосфаты, а трифосфаты -
сильнее, чем дифосфаты.
2.2.6.2. Оптимизация условий разделения. Как отмечалось в
предыдущем разделе, pH элюента представляет собой важный параметр,
влияющий на процесс удерживания. Не меньшую роль играет и ионная сила, ее
увеличение вызывает уменьшение коэффициента емкости. Если удерживание
осуществляется только по механизму ионного обмена, то зависимость k от
обратного значения ионной силы имеет вид прямой, выходящей из начала
координат. На рис. 2.22 эта зависимость
Хроматографическая колонка 67
Рис. 2.23. Гидрофобное взанмодействие амииокнслот с нонообменником.
Неподвижная фаза: катионообменннк на основе силикагеля; элюеит: цитратный
буфер, pH 4,8, с NaCl (/=*0,1 и 0,5); проба: 1 - D2O (инертное
соединение), 2 - фенилаланин, о - лнзнн, 4 - гистидин, 5 - аргинин.
проиллюстрирована на примере анионообменника с четвертичными аммониевыми
группами [79].
Интерпретировать влияние ионной силы на удерживание более сложно,
если кроме ионного обмена наблюдается гидрофобное взаимодействие
неподвижной фазы и разделяемых веществ. В этом случае возможна
конкуренция двух процессов- ионного обмена (k уменьшается с увеличением
ионной силы) и высаливания (см. разд. 2.2.4.2), если с увеличением ионной
силы k увеличивается. На рис. 2.23 приведен пример разделения аминокислот
на катионообменнике при двух значениях ионной силы [79]. При низкой
ионной силе фенилаланин элюируется первым, непосредственно после выхода
инертного вещества (&=1,33). Увеличение ионной силы от 0,1 до 0,5 при
сохранении прочих условий приводит к изменению порядка элюирования:
фенилаланин элюируется предпоследним. Значения k других аминокислот в
рассматриваемом примере существенно уменьшались (например, для аргинина
от 7,2 до 2,1),
5*
68 Глава 2
напротив, k фенилаланина несколько возрастал (до 1,44). Увеличение k
фенилаланина - гидрофобной аминокислоты - обусловлено эффектом
высаливания. Для уменьшения влияния гидрофобного взаимодействия в элюент
добавляют органический растворитель (см. разд. 2.2Л.2). Следует отметить,
что ионообменники и водно-метанольные элюенты приемлемы для разделения
незаряженных нейтральных веществ, например сахаров [80], и что
осуществляется оно по распределительному механизму (см. разд. 2.2.4.2).
Недостаточная оптическая прозрачность буферных растворов при низких
длинах волн в УФ-области спектра, особенно при длинах волн ниже 230 нм,
представляет собой серьезное препятствие. Наличие полифосфатов в
Предыдущая << 1 .. 20 21 22 23 24 25 < 26 > 27 28 29 30 31 32 .. 296 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed