Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
При таком подходе, естественно, не сохраняется исходное взаимное расположение колоний. Кроме того, не каждый из клонов при рассеве после амплификации будет представлен тем же числом колоний, что и в исходной библиотеке. Статистику этого процесса можно описать при помощи распределения Пуассона, считая, что все клоны растут с одинаковой скоростью (часто неточное, но единственно возможное приближение). Так, если библиотека, поддерживавшаяся на N фильтрах, была смешана и затем заново рассеяна, то для того, чтобы все оригинальные клоны были представлены в этом рассеве, необходимо получить 1,5—2 N фильтров. Этот вопрос обсуждается в работе Кларка и Карбона [26]. Мы считаем, что скрининг дополнительных фильтров безусловно оправдан при поддержании и рассеве редких и ценных библиотек кДНК. Методика, иллюстрирующая один из способов приготовления и амплификации библиотек кДНК, приведена в табл. 14.
Литература
1. Cohen S. N„ Chang А. С. Y., Hsu L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972).
2. Mandel M„ Higa A. J. Mol. Biol., 53, 159 (1970).
3. Lederberg E. M„ Cohen S. N. J. Bacteriol., 119, 1072 (1974).
4. Taketo A. J. Biochem., 72, 973 (19l72).
5. Taketo A. J. Biochem., 75, 59 (1974).
>6. Taketo A., Kuno S. J. Biochem., 75, 895 (1974).
7. Kretschmer P. J., Chang А. С. Y., Cohen S. N. J. Bacteriol., 124, 225 (1975).
8. Enea V., VovisG. F„ Zinder N. D. J. Mol. Biol., 96, 495 (1975).
9. Kushner S. R. In: Genetic Engineering, Boyer H. B. and Nicosia S. (eds.),
Elsevier, Amsterdam, p. 17, 1978.
10. Norgard М. V., Keem K., Monahan J. J. Gene, 3, 279 (1978).
11. Dagert M„ Ehrlich S. D. Gene, 6, 23 (1979).
12. Morrison D. A. In: Methods in Enzymology, Wu R. (ed.). Academic Press, Inc., NY, Vol. 68, p. 326 (1979).
13. Jones J. M„ Primrose S. ?., Robinson A., Ellwood D. C. J. Bacteriol., 146,
S41 (1981).
174
Глава 6
14. Bergmans Н. Е. N., van Die I. М., Hoekstra W. P. M. J. Bacteriol., 146, 564 (1981).
15. Hanahan D. J. Mol. Biol., 166 (1983).
16. Appleyard R. K- Genetics, 39, 440 (1954).
17. Casadaban M„ Cohen S. J. Mol. Biol., 138, 179 (1980).
18. Meselson M„ Yuan R. Nature, 217, 1110 (1968).
19. Curtiss R., Ill, Inoue М., Pereira D., Hsu J. C., Alexander L., Rock L. In: Molecular Cloning of Recombinant DNA, Scott W. A. and Werna R. (eds.)v Academic Press, NY, p. 99 (1977).
20. Hicks J. B„ Hinnen A., Fink G. R. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43, 1305 (1979).
21. Peucho М., Hanahan D„ Lipsich L., Wigler M. Nature, 285, 207 (1980).
22. Hanahan D., Lane D., Lipsich L., Wigler М., Botchan M. Cell, 21, 127 (1980).
23. Hanahan D., Meselson M. Gene, 10, 63 (1980).
24. Hanahan D., Meselson M. In: Methods in Enzymology, Wu R. et al. (eds.). Academic Press, NY, Vol. 100, p. 333 (1983).
25. Maniatis T„ Hardison R., Lacy E„ Lauer J., O’Connel C., Quon D., Sim G. K., Efstradiadis A. Cell, 15, 687 (1978).
26. Clarke L., Carbon J. Cell, 9, 91 (1976).
ГЛАВА 7
ПРИМЕНЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ИНДУЦИРОВАННЫХ IN VITRO МУТАЦИИ, НЕ ИМЕЮЩИХ ФЕНОТИПИЧЕСКОГО ПРОЯВЛЕНИЯ У E.COLI
Джанни Чезарени, Чинца Трабони, Дженнаро Чилиберто, Лючиана Денте и Рикардо Кортесе
В этой главе мы опишем методики, упрощающие идентификацию и отбор мутаций в заранее выбранных фрагментах ДНК и введение их в нужный генетический контекст. Эти методики можно использовать для отбора мутаций, не имеющих фенотипического проявления у Е. coli. Для выявления таких мутаций создают генетические конструкции, в которых они оказываются сцепленными с маркерами, легко идентифицируемыми у Е. coli.
1. Общий метод индукции и выявления замен оснований
При идентификации последовательностей ДНК, важных для какой-либо функции, часто бывает полезно или даже необходимо очертить границы искомой области. Для этого нужен быстрый и точный метод «зондирующего» мутагенеза. Основываясь на полученных этим методом результатах, исследователь может применять уже более специфичные методы мутагенеза in vitro, например с использованием синтетических олигонуклеотидов [1].
Недавно мы разработали простую методику, позволяющую быстро выделить и идентифицировать большое число мутантов, имеющих замены пар оснований в любом заранее выбранном участке ДНК. Метод основан на способности обратной транскриптазы включать некомплементарные основания в ходе синтеза ДНК in vitro и построен так, что бактериальные клоны, несущие нужные мутации, имеют легкоразличимый фенотип [2, 3]. Лучше всего, если последовательность-мишень клонирована в одноцепочечном векторе. Как показано в гл. 5 этой книги, любую плазмиду после несложных манипуляций легко получить в одноцепочечной форме. Таким образом, описываемая нами методика может найти весьма широкое применение [4].
1.1. Мутагенез
Для затравки синтеза ДНК in vitro небольшой фрагмент отжигают с соответствующей одноцепочечной ДНК-матрицей. При элонгации в присутствии неполного набора дезоксинук-
