Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
176
Глава 7
леозидтрифосфатов происходит включение некомплементарного нуклеотида в тех случаях, когда нет комплементарного [5]. Эта ошибка не может быть исправлена полимеразами, которые не обладают З'-экзонуклеазной активностью, например обратной транскриптазой. После того как неправильное включение произошло, затравку, несущую на З'-конце некомплементарный нуклеотид, можно достроить в присутствии всех четырех нуклеотидов [3, 5]. Этим способом легко произвести замену любой пары оснований вблизи З'-конца затравки. Обычно эта замена оказывается единственной. Если-, однако, комплекс затравки с матрицей инкубировать с обратной транскриптазой в отсутствие более чем одного дезоксинуклеотида, можно получить множественные замены пар оснований в положениях, комплементарных недостающим нуклеотидам.
1.2. Методика селекции мутантов
Как показали Борриас с соавт. [6], селекцию фаговых частиц 0X174 дикого типа можно проводить, трансформируя клетку Е. coli одноцепочечной ДНК 0X174, которая несет amber-мутацию и отожжена с коротким фрагментом ДНК 0X174, включающим соответствующую последовательность дикого типа. В клетке затравка дикого типа достраивается до полной комплементарной цепи. Полученная двухцепочечная ДНК реплицируется с образованием как вирусов дикого типа, так и мутантных. Основываясь на этих данных, мы объединили удобный для селекции маркер с затравкой, использующейся для реакции мутагенеза in vitro. Таким образом, генетический маркер оказывается ассоциированным с цепью ДНК, синтезированной in vitro, и, следовательно, «сцепленным» с любой ошибкой, допущенной в ходе элонгации цепи ДНК [3, 4].
Можно использовать различные селективные маркеры. Ниже будет представлена подробная методика, которую мы применили для введения in vitro множественных мутаций в эукариотический ген тРНК. Подход, использованный нами в этих экспериментах для того, чтобы отличить фаговые частицы М13, являющиеся потомками матрицы, от фаговых частиц — потомков затравки, основан на способности а-пептида [3-галак-тозидазы к комплементации a-фрагмента и расщеплению 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-?5-0-галактозида (X-Gal) с образованием синей окраски. Важное свойство а-пептида состоит в том, что его N-концевая последовательность не важна для функционирования и может быть заменена любой последовательностью аминокислот. На этом свойстве основана разработанная нами методика индукции замен пар оснований в лю-
Генетические маркеры для селекции индуцированных, мутаций.
177"
бом коротком фрагменте ДНК и селекции клонов, содержащих эти мутации. Процедура состоит в следующем.
1. Фрагмент ДНК дикого типа, предназначенный для мутагенеза, клонируют в фаговом вектор.е М13тр внутри последовательности а-пептида р-галактозидазы таким образом, чтобы нарушить трансляционную рамку считывания. Содержащий такую вставку фаг не способен к синтезу активной {5-галакто-зидазы и будет формировать бесцветные бляшки на чашках,, содержащих X-Gal [7].
2. Одноцепочечную ДНК дикого типа отжягают с коротким: фрагментом ДНК, несущим инсерцию или делецию одного ила двух оснований, которые восстанавливают правильную рамку считывания. З'-Конец этого фрагмента должен быть комплементарен последовательности ДНК вблизи области, в которой необходимо произвести замены оснований. Важно представлять себе, что инсерции или делеции, восстанавливающие рамку считывания, могут располагаться вне подвергаемого мутагенезу гена. Их удобно размещать в прилегающих последовательностях вектора.
3. Для введения в нужную позицию некомплементарного нуклеотида затравку элонгируют в присутствии неполного набора дезоксинуклеозидтрифосфатов. Затем добавляют недостающие нуклеотиды и элонгацию продолжают. Отожженный комплекс используют для трансформации Е. coli. Фаги-потомки матрицы и мутировавшей цепи формируют соответственно бесцветные и синие бляшки. Синие бляшки будут содержать частицы фага с нужной мутацией. Так как затравку получают обычно путем расщепления ДНК рестриктазами, во многих случаях ее З'-ОН конец расположен не совсем так, как требовалось бы для получения нужной мутации. В таких случаях необходимо модифицировать затравку, слегка удлинив или укоротив ее. Для этого можно использовать полимеразную или экзонуклеазную активность фрагмента Кленова ДНК-по-лимеразы I Е. coli, подобрав соответствующий набор дезокси-нуклеотидов.
Пример использования этой методики приведен на рис. 1. Матрицей (приготовленной так, как описано в табл. 1) служил фрагмент ДНК, кодирующий эукариотическую тРНКРго и клонированный по fcoRI и BamHI в М13тр701 [2]. Образовавшийся рекомбинант, обозначенный R78B, давал бесцветные бляшки, так как фрагмент, введенный в кодирующую область гена (3-галактозидазы, вызывал сдвиг рамки на —1 нуклеотид. Затравку получали из другой плазмиды, обозначенной как R78Bo. Эта плазмида была получена из R78B путем достройки липкого конца ВатШ. Добавленные при этом четыре основания восстанавливали правильную рамку считывания гена [З-gal, поэтому фаговые бляшки с R78Bo были окрашены в
