Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Поддержание колоний на нитроцеллюлозных фильтрах и приготовление реплик обладают тем преимуществом, что каждый клон сохраняет свое положение. При этом нет опасности, что какие-либо клоны окажутся неадекватно представленными в библиотеке в результате дифференциального роста. Напротив, при выращивании популяции рекомбинантов в жидкой культуре некоторые из них могут стать сверх- или недопредставленными в библиотеке. При выращивании на фильтрах рост клеток, обладающих повышенной жизнеспособностью, видимо, тормозится из-за физических условий, менее благоприятных для быстрого и длительного роста, чем условия, в которых находится изолированная клетка в жидкой культуре. Главный недостаток поддержания колоний на фильтрах — трудоемкость их репликации. Это затрудняет получение большого числа копий плазмидной библиотеки и не дает возможности передавать ценные библиотеки другим исследователям.
Чтобы сочетать удобства амплификации на фильтрах и простоту обращения с жидкой культурой, можно пользоваться обоими способами одновременно. Клоны амплифицируют в виде колоний на фильтрах, что не допускает преобладания хоро-
Таблица 14. Амплификация и хранение плазмидных библиотек
А. Приготовление аликвот амплифицированной библиотеки
1. С плазмидной библиотеки, хранящейся в виде колоний на нитроцел-люлозных фильтрах, снимите свежий комплект реплик, как описано в работах [23, 24]. Проинкубируйте реплики при 37 °С до тех пор, пока размер колоний не достигнет 0,5—1 мм (считая, что плотность колоний составляет 5000— 20 000 колоний на фильтр). Во избежание загрязнения посторонними микроорганизмами рассев, репликацию и последующие стадии рекомендуется проводить в ламинарном шкафу.
2. Поместите фильтры вверх колониями в пустые чашки Петри. Добавьте по 10 мл среды SOB, содержащей 20% глицерина. Диспергируйте колонии, растирая их на фильтре резиновым шпателем.
3. Несколько раз наберите и выпустите суспензию из пипетки, затем перенесите ее в стерильную пробирку и поместите на лед. Окончательно диспергируйте клетки на встряхивателе. Титр клеток должен составить около 10э/мл. На этой стадии колонии с каждого фильтра можно объединить в смесь, соответствующую полной библиотеке, либо обрабатывать по отдельности в виде N наборов колоний с N исходных фильтров, представляющих полную библиотеку.
4. Разлейте суспензию клеток по 100—500 мкл в полипропиленовые пробирки. Быстро заморозьте в смеси сухого льда с этанолом или жидком азоте и храните в жидком азоте или при —70 °С.
Б. Восстановление амплифицированной библиотеки из замороженных аликвот
1. Выньте аликвоту (или набор аликвот) из холодильника и выдержите при комнатной температуре. Как только суспензия растает, перенесите в лед.
2. Чтобы получить набор первичных аликвот, разбавьте аликвоту (аликвоты) в 10 раз средой SOC.
3. Приготовьте набор серийных разведений первичной аликвоты (аликвот) для определения колониеобразующего потенциала. Так как исходный титр клеток составлял около 109/мл, титр первичных аликвот (без учета гибели клеток) составит около 108/мл. Титр жизнеспособных клеток, однако, медленно понижается при хранении, поэтому реальный титр окажется несколько ниже, чем при отборе аликвот.
4. Рассейте по 10 мкл 102, 103, 104 и 105-кратных разведений первичной аликвоты на чашках с подходящими антибиотиками. Инкубируйте ночь для образования колоний. Первичную аликвоту (аликвоты) храните на льду, а разведения выбросьте.
5. После рассева серийных разведений определите титр первичных аликвот. В течение 24 ч хранения на льду титр понижается не более чем на 10% от исходного значения. Приготовьте свежее разведение первичной аликвоты с концентрацией около 105 колониеобразующих единиц/мл. При посеве 50—250 мкл разведения на чашку плотность колоний составит 5000— 25000. Рассейте на нитроцеллюлозных фильтрах, проинкубируйте до образования колоний и приготовьте реплики так, как описано в работах (24, 25]. Так как исходное расположение колоний было нарушено, для полного представления всех клонов следует засеять большее число фильтров, чем было в исходной библиотеке. Аликвота объемом 100 мкл, полученная с фильтра, содержавшего 104 колоний, содержит около 107 клеток или около 1000 копий исходного набора клонов. Таким образом, даже после длительного хранения из этой аликвоты можно получить все клоны, содержавшиеся в исходном их наборе.
Методы трансформации Е. coli
173
шо растущих (часто нерекомбинантных) клонов. Затем колонии с фильтров переносят в жидкую среду, бактериальную суспензию делят на аликвоты и хранят при —70 °С или в жидком азоте. Один фильтр, несущий 20 000 колоний диаметром 1 мм, содержит около 1010 клеток. Если их суспендировать в 10 мл и заморозить в 100 аликвотах, то каждая из аликвот будет исходно содержать 108 клеток (или около 5000 копий каждого клона). Поэтому, хотя титр жизнеспособных клеток и понизится при хранении или транспортировке, оставшийся колониеобразующий потенциал будет достаточен для получения многих копий исходной библиотеки. Этот метод аналогичен методу амплификации фаговых библиотек с помощью получаемых на чашках лизатов [25].
