Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 82

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 76 77 78 79 80 81 < 82 > 83 84 85 86 87 88 .. 253 >> Следующая

2. Отбор прозрачных бляшек, образуемых фаговыми частицами, содержащими в своем геноме «мутантную» плазмиду. 3. Отбор мутных бляшек, образуемых фагом после выщепления плазмиды. 4. Идентификация фаговых частиц, несущих искомую мутацию, по их способности придавать синюю окраску колониям с плазмидами дикого типа.
Правильная рамка __ ________________________Sau3ft-<ppameHT
Р-гТактозмазы устойчивости нтетрацинлину
5’-atg асс atg att acg aat tcc egg gGA ТСС TCT ACG CCG 6AC GCA TCG TGG CCG GCA TCA CCG GCG CCA CAG ОТО CGG TT(.
rPH . Смещенная рамка
— — 1---------------считывания- -----
устойчивости 5аиЗД р-галактозидазы
CTG GCG ССТ АТА TCG CCG АСА TCA CCG ATG GGG AAqIhc УдГ4:да~^e'er4дсТ4д'сс^аад^сТР-д'дс4 аТР ддс' с - З1 . ^ —
Д - G 111
Мутаи.кя, восстанавливающая правильную рамку считывания
Рис. 4. Нуклеотидная последовательность фрагмента длиной 91 п.н., введенного в область полилинкера pUC8. Строчными буквами обозначены нуклеотиды последовательности pUC8, а прописными — фрагмента 91 п.н., вырезанного из гена устойчивости к тетрациклину (tetR) pBR322. Изменение рамки считывания после вставки вызывает превращение правильных кодонов (обозначены дугами над исходными триплетами pUC8) в ошибочные, подчеркнутые прямыми линиями. Указана также деления одной пары оснований (AG111), восстанавливающая правильную рамку считывания.
Генетические маркеры для селекции индуцированных мутаций
187
f 15 (PuCb* на рис. 3) получена из pUC8-91/3 путем делеции G-остатка в результате частичного гидролиза ДНКазой I [18]. Эта делеция (рис. 4, мутация AG111) восстанавливает правильную рамку считывания, что приводит к появлению активной р-галактозидазы и образованию синих колоний на содержащем X-Gal агаре. В таком эксперименте в ходе переноса мутации из одного окружения в другое фенотип «синие колонии» используется как маркер делеции. Фаг G6 (ЯаЬс на рис. 3) —производный от NM616 [19], в котором fcoRI-фраг-мент, содержащий N-концевую последовательность гена ^-га-лактозидазы, заменен РиыП-.ЕсоЩ-фрагментом pBR322, содержащим ген устойчивости к тетрациклину.
Целью эксперимента являлся обмен аллельными последовательностями посредством интеграции — вырезания. В приведенном примере для отбора на стадии интеграции в качестве маркера использовали фенотип нарушенной иммунности (aber-
Таблица 5. Интеграция плазмид, несущих мутации, в фаг, содержащий соответствующий ген дикого типа
Метод проиллюстрирован на примере гибридов, образующихся между фагом G6 (kabc на рис. 3) и плазмидой pUC9-91/3 f 15 (PuCb* на рис. 3).
1. Засейте 5 мл L-бульона одной колонией Е. coli (штамм 71/18), несущей плазмиду pUC8-91/3fl5. Инкубируйте на качалке при 37 °С до насыщения.
2. Приготовьте одну чашку с 1%-ным агаром на L-бульоне1). В 4 мл верхнего слоя (0,7%-ный агар на L-бульоне) внесите 0,2 мл клеток 71/18 (pUC8-91/3fl5). Вылейте на чашку и оставьте для застывания на 10 мин при комнатной температуре.
3. Капните на чашку лизат фага G6 (105—10? бляшкообразующих единиц) и проинкубируйте ночь при 37 °С.
4. Из области бактериального лизиса отберите пастеровской пипеткой немного верхнего агара и перенесите в 1 мл буфера для разведения фага2). Добавьте каплю хлороформа.
5. В три пробирки внесите 100, 30 и 10 мкл суспензии фага.
6. В эти три пробирки добавьте по 100 мкл клеток 71/18 в 10 мМ MgS04 и проинкубируйте 10 мин при комнатной температуре.
7. В каждую пробирку внесите по 3 мл верхнего слоя и вылейте на чашки с агаром на L-бульоне. Проинкубируйте при 37 °С. Среди множества мутных бляшек появятся прозрачные, образовавшиеся в результате интеграции плазмиды в хромосому фага.
8. Пастеровской пипеткой отберите прозрачную бляшку и перенесите в 1 мл фагового буфера.
9. Разбавьте эту суспензию в 100 раз фаговым буфером и внесите 100 и 20 мкл в пробирки, содержащие по 100 мкл клеток 71/18 в 10 мМ MgS04.
10. Добавьте в пробирки по 3 мл верхнего агара, вылейте смесь на чашку, проинкубируйте ночь при 37 °С. На фоне бактериального газона должны быть хорошо заметны изолированные прозрачные бляшки, образованные гибридом плазмиды и фага.
1) Состав L-бульона: бакто-трнптон — 10 г; дрожжевой экстракт — 5 г; NaCl — 5 г на литр.
2) Состав фагового буфера: 10 мМ трис-НС1 pH 7,4; 10 мМ MgS04-7H20; 0,01% же-
латина.
Таблица 6. Селекция фаговых частиц с исключенной плазмидой
A. Селекция с помощью ЭДТА
1. Отберите десять хорошо отделенных друг от друга прозрачных бляшек, образованных гибридными фаговыми частицами, несущими плазмиду, и перенесите их в 10 пробирок, содержащих стерильный 0,1 М раствор ЭДТА pH 8,0. Проинкубируйте 60 мин при 50 °С.
2. 5 и 20 мкл этой суспензии смешайте с 0,2 мл клеток 71/18 (в 10 мМ MgSO*) и 3 мл верхнего слоя и вылейте на чашки с L-агаром1). Проинкубируйте ночь при 37 °С. Проверьте, появились ли мутные бляшки2».
Предыдущая << 1 .. 76 77 78 79 80 81 < 82 > 83 84 85 86 87 88 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed